DCFH-DA 实时追踪烟草叶片 ROS 动态

DCFH-DA 是一种广泛应用于活细胞内活性氧（ROS）实时检测的荧光探针，具有高灵敏度、操作简便、兼容多种生物样本的特点，是研究氧化应激、抗逆机制及药物筛选的理想工具。

一、核心优势

1.高灵敏度

   a.可检测低至纳摩尔级别的ROS，适用于微量样本分析。
   b.在低温胁迫下，成功捕捉转基因烟草中ROS的细微变化。

2.活细胞兼容

   探针穿透细胞膜后，经酯酶水解为DCFH，仅与胞内ROS反应生成荧光DCF，实现活细胞原位检测。

3.操作简便

   无需复杂的预处理，孵育后直接观察，适用于高通量筛选（如96孔板检测）

4.多场景应用

   a.植物抗逆研究：如低温、干旱、盐胁迫下的ROS动态（文献中用于验证基因对ROS的调控）。

   b.医学与药理：检测药物诱导的氧化损伤或抗氧化剂效果。

   c.微生物学：病原体-宿主互作中的氧气爆发监测。
 

二、文献中DCFH-DA的应用与操作步骤

检测对象：

用文献中使用DCFH-DA检测了烟草叶片中活性氧的积累水平，特别是验证了转基因烟草（过表达CbRCI35基因）在正常条件和低温胁迫下ROS的动态变化。通过该实验，研究者发现CbRCI35通过调控ROS稳态增强植物的抗寒性。

实验流程

1.样本处理

  a.取4周龄烟草叶片，切成小圆片（直径约5 mm）。

  b.将叶片圆片浸入含有10 μM DCFH-DA探针的溶液中（避光条件）。

2.探针孵育

在37°C下避光孵育20分钟，使探针充分穿透细胞膜并被细胞内酯酶水解为DCFH（非荧光形式）。DCFH与ROS（如H₂O₂）反应后生成荧光物质DCF。

3.洗涤去除多余探针

孵育后，用20 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0） 洗涤叶片3次，彻底去除未进入细胞的探针。

4.荧光信号检测

  a.使用激光共聚焦显微镜（Zeiss 710） 观察DCF的荧光信号（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

  b.通过荧光强度定量ROS水平，对比野生型与转基因植株的差异。

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文献链接：Frontiers | CbRCI35, a Cold Responsive Peroxidase from Capsella bursa-pastoris Regulates Reactive Oxygen Species Homeostasis and Enhances Cold Tolerance in Tobacco