Amplite 用于测定NAD和NADH定量的试剂

 

        AAT Bioquest^®开发了一系列比色和荧光测定法，用于测定可见光谱（400nm–700nm）中的NAD+和NADH。定量的NAD⁺及其还原形式NADH的产生或消耗对于监测NAD⁺/ NADH酶介导的反应或筛选这些反应的调节剂和底物很重要。但是，传统的NAD⁺和NADH测定分析并非没有他们的注意事项。许多现有方法都是在340nm的紫外波长下的吸收来监测NADH的变化。在该波长下，生物样品和塑料由于光散射和自发荧光而产生干扰。这些干扰大幅度的降低了测定灵敏度，可能需要使用反分析来鉴定干扰检测方法的潜在化合物。此外，在UV范围内进行的分析需要使用昂贵的石英比色皿和微孔板。我们的荧光测定法具有更高的灵敏度，需要使用荧光酶标仪或类似设置。而比色法操作简单，可以使用标准吸光度酶标仪进行读取。 

 

NAD⁺检测

        虽然市场上有几种测定法可用于量化NADH以及生物样品中NAD + /NADH的总量或比例，但对于NAD +的定量分析几乎没有。由于NAD⁺的固有特性。当紫外光在259nm处吸收峰值时，NAD⁺是非荧光的，因此它的其测量不够准确。然而，AAT Bioquest^®开发的荧光法NAD +检测试剂盒，使用专有荧光传感器Quest Fluor NAD，专门检测NAD⁺。我们的试剂在00μL测定体积中可以检测到少至30 nM的NAD⁺。Quest Fluor NAD探针对NADH几乎没有反应，与NAD+结合后，产生与NAD+浓度成比例的荧光信号。简单的添加-混合-读取方法使该测定适用于96孔或384孔微量滴定板形式的高通量筛选。

 

图1.使用Germini酶标仪（Molecular devices），在96孔黑色/固体底板中用Amplite 荧光NAD⁺测定试剂盒（货号：15280）测量NAD⁺剂量响应。A：NAD⁺标准曲线，在孵育20分钟时可检测到低至30nM的NAD⁺（n = 3）。B：NAD⁺和NADH反应的比较。C：在溶液中存在100μMNADH的NAD⁺标准曲线。从孵育20分钟（n = 3）可以检测到从NADH转化的低至0.3％的NAD⁺（~300nM）。

 

NADH检测

        NADH（NAD⁺的还原形式）的检测可以用比色法或荧光法测定。Amplite 比色法NADH检测试剂盒采用新型生色传感器，比传统的NADH探针更有优势。与大吸收在340 nm处的传统探针相比，我们的生色传感器在NADH减少时在460 nm处具有大吸光度。因为这两个值是成比例的，所以从460nm处的吸光度增加，可以很容易计算在100μL测定体积中少至3μM的NADH的浓度。Amplite 荧光法NADH检测试剂盒是一种均相的单试剂加成试验，可在酶循环反应中专门的识别NADH。这种酶循环反应显著提高了检测灵敏度，在100μL的分析体积中仅检测1μm的NADH。

图2.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADH检测试剂盒（Cat＃15261）测量NADH剂量反应。在孵育1小时（n = 3）时，可以检测到低至1μM（100pmol /孔）的NADH，而NAD⁺没有响应。

 

总NAD⁺/ NADH和NAD⁺/ NADH比率测定

        NAD⁺/ NADH比率（氧化形式和还原形式之间的平衡）是细胞氧化还原状态的重要指标，测量时，可以了解细胞的代谢活动和健康状况。Amplite 比色法和荧光法总NAD⁺/ NADH和NAD⁺/ NADH比率检测是一系列均用于灵敏检测总氧化和还原NAD⁺以及它们在生物样品中的比例。这些测定依赖于酶循环反应系统，其快速地识别具有优异灵敏度的NAD+/ NADH。此外，已经证明荧光测定，由于其光谱特性（在红色可见范围内），减少了生物样品的干扰。对于研究人员而言，这些检测试剂简单方便。在使用之前不需要从样品中纯化NAD⁺/ NADH，并且每个检测都很容易地适应自动化，无需分离步骤。根据检测格式不同，只需使用460 nm的吸光度酶标仪或Ex/Em = 540/590 nm的荧光酶标仪进行混合读取。

 

图3. Amplite 比色法NAD⁺/ NADH比率检测试剂盒（货号：15273）用于测量NAD⁺使用SpectraMax在96孔白色壁/透明底微板/NADH比率^®酶标仪（Molecular Devices）中。使用或不使用NAD⁺提取溶液处理等量的NAD⁺和NADH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。在460nm读取信号。根据图中所示的吸光度计算NAD⁺/ NADH比率。

 

图4.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在96孔黑色板中用Amplite 荧光法NAD⁺/NADH比率测定试剂盒（Cat＃15263）测量总NADH /NAD⁺及其提取物剂量反应。使用或不使用NADH或NAD ⁺提取溶液处理25μL等量的NAD⁺和NADH15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。在加入75μLNADH反应混合物后30分钟，在Ex/Em= 540/590nm处读取信号。从具有NADH反应的那些孔的值中减去空白信号。

 

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