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重要免责声明：以下是使用AF NHS酯系列产品标记蛋白/抗体示例方案。 该方案仅提供指南，实际请根据您的实验进行调整。该标记方案不适用于含有BSA、明胶、游离氨基酸或铵盐的抗体或蛋白质。
一、实验准备
蛋白选择
蛋白： IgG - Immunoglobulin G
分子量（kDa）:150
材料准备
- 1.AF 琥珀酰亚胺酯
2.IgG
3.1 M 碳酸氢钠缓冲液
4.PBS,pH:7.2-7.4
5.1 M NaOH 或 1 M HCl
6.DMSO
7.Sephadex® G-25、Bio-Gel®P-6 DG或其他层析柱
8.Spin Column旋转离心柱
1 M 碳酸氢钠配制
（碳酸氢钠分子量为84.007 g / mol）
所需体积：50ul
碳酸氢钠质量：4.2mg
配制1 M 碳酸氢钠的步骤：
1.向合适的容器中添加4.2 mg NaHCO3
2.然后添加蒸馏水直至溶液体积到达50ul
3.缓冲液的pH值应保持在8.5-9.5之间
4.如果pH值低于8.5，请通过添加1 M NaOH进行pH调整
5.如果pH值高于9.5，请通过添加1 M HCl进行pH调整
二、实验步骤
1.准备PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）和1 M碳酸氢钠溶液。
2.
2.1检查IgG溶液中是否有杂质
A:检查蛋白质是否含有防腐剂，例如叠氮化钠或小分子稳定剂
B:检查蛋白质是否溶解在TRIS或甘氨酸缓冲液中
（没有则不含杂质）
2.2其它步骤
如果没有其它步骤，请继续第三步
3.
3.1准备IgG储备溶液
蛋白质的形式：悬浮液
3.2悬浮液中制备IgG溶液
A:初始蛋白质浓度：10 mg / mL
B:所需蛋白浓度：10 mg / mL
C:所需体积100ul
D:将100μL初始的（10 mg / mL）蛋白质溶液转移到合适的容器中。然后添加0.00μLPBS缓冲液（pH 7.2-7.4），使体积为100μL。 蛋白质标记溶液的浓度为10 mg / mL，等于0.0667 mM。
4.准备10 mg / mL AF 琥珀酰亚胺酯标记溶液
在合适的容器中，将1 mg AF 琥珀酰亚胺酯溶解在100μLDMSO中，制成浓度为10 mg / mL的标记溶液
5.
5.1检查您IgG溶液的pH
蛋白质溶液的pH值是否在8.5-9.5之间（如果不在，请进行步骤5.2）
5.2其它步骤
通过添加1 M碳酸氢钠（pH 8.5-9.5）来调节蛋白质溶液的pH，其体积应等于抗体溶液的5％。
6.
6.1确定蛋白质与蛋白质的标记比例（AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的比例）
选择所需的AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的比例。 10：1为结果，可选择的比例有5：1、10：1 15：1或20：1（IgG的标记单位为：mg）
6.2在进行缀合反应之前，请对以下各项进行检查：
A:确保DMSO的数量占总反应量的不到10％
B:在开始反应之前，请确保已准备好AF 琥珀酰亚胺酯标记溶液，蛋白质溶液和缓冲液。
7.进行AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的缀合反应
7.1使用10：1的摩尔比标记1 mg的蛋白质，将（根据实验调整）μL AF 琥珀酰亚胺酯溶液混合到装有100μL蛋白质溶液的小瓶中，并混合均匀
7.2 在室温下（37°C）连续旋转或摇动您的反应混合物1小时。
8.使用1 mL旋转柱纯化蛋白缀合物
8.1准备Sephadex®G-25，BioGel®P-6 DG或其他脱盐柱；
注意：1 mL离心柱适合纯化100μL缀合物
8.2排干溶液（顶部排出），并使用约4 mL PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）进行缓冲液更换；
8.3将色谱柱在2000X旋转2分钟，然后将15 mL离心管换成全新的；
8.4将反应混合物（直接来自步骤7）从脱盐柱顶部加入；
8.5加入10μLPBS缓冲液（pH 7.2-7.4）；
8.6 2000X离心柱5分钟；
8.7收集洗脱液并使用分光光度计（例如NanoDrop）检测浓度。
9.使用我们的DOL计算器表征蛋白质缀合物
Degree of Labeling (DOL) Calculator
10.结果与建议
10.1如果您对蛋白质缀合物的DOL不满意，则可以返回到步骤6并尝试使用不同的标记率；
10.2如果您对蛋白质缀合物的DOL感到满意，请用PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）和等分试样稀释以多次使用；
10.3如果您以后要使用蛋白质缀合物，请按照存储规范进行存储。
三、其他信息
1. 1 M NaOH配方
1.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水；
1.2在混合的同时向溶液中缓慢加入100 mg NaOH；
1.3加入蒸馏水直至体积为2.5 mL；
1.4将溶液在室温下储存在塑料容器中。*这是放热过程，应选择适当的防护措施*
2. 1M HCl配方
2.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水；
2.2边搅拌边向溶液中缓慢加入91.15 mg盐酸（HCl）；
2.3向溶液中加入500μL蒸馏水，体积为2.5 mL；
2.4在室温下将溶液储存在塑料容器中。
3.储存条件
3.1AF 琥珀酰亚胺酯应储存在<-15°C下，干燥并避光；
3.2AF 琥珀酰亚胺酯DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存少于两周；
3.3蛋白质缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度存储；
3.4缀合物溶液可以在4°C下保存2个月，如果在2 mM叠氮化钠存在下避光保存，则不会发生明显变化；
3.5对于长期保存，必须将蛋白质缀合物冻干或分成单份并在 ≤–60°C避光保存。
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