使用TUNEL分析评估DNA片段化

 

        细胞凋亡或程序性细胞死亡是一种高度复杂的细胞途径。 响应于凋亡刺激，细胞将经历一系列受控步骤，导致重要细胞组分的有组织的破坏，分选和再循环。 凋亡细胞可以通过不同的形态学和生物化学标记物来表征，因为它们沿细胞凋亡途径向下进展。 这些特征可包括细胞收缩，染色质浓缩，膜结合的凋亡小体的形成和质膜外膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）磷脂的表达。 然而，被认为是凋亡细胞的“标志性”指标的该途径的一部分是通过活化的内切核酸酶对核小体间DNA的片段化以及通过由邻近细胞吞噬的凋亡小体水平转移该遗传物质。

        细胞凋亡DNA片段化是内切核酸酶DNA片段化因子或DFF的DNA降解的结果。 Wang及其同事（Liu等人，1997）将DFF鉴定为由DNA片段化因子45和40（DFF45和DFF40）组成的异二聚体蛋白质。 DFF45表现为阻碍DFF40裂解功能的抑制剂。通过效应酶半胱天冬酶3切割DFF45引发DFF40的活化。在DFF45解离后，活化的DFF40可以在核小体间位点引发染色体DNA的切割。在这些位点的切割导致寡核小体DNA片段的大小约为180-200个碱基对。使用琼脂糖凝胶电泳可以将这种DNA片段的鉴定可视化为梯状图案。然而，这种技术费力，耗时并且主要用于收集定性数据。对于检测核小体间DNA片段化的更复杂和成熟的方法，我们建议使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记或TUNEL测定。

 

TUNEL Assay

原理

        TUNEL测定法是一种原位DNA染色技术，对检测DNA链断裂或DNA片段化敏感。 它采用称为末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的专门DNA聚合酶，用染料修饰的dUTP核苷酸检测并酶促标记片段化DNA的游离3'-OH末端。 借助荧光仪器，可以观察和测量TUNEL标记的DNA片段。 与定性琼脂糖凝胶电泳方法相反，TUNEL测定提供单细胞水平的细胞凋亡的定量检测（图1）。

图1.与未处理的对照相比，用100nM或1μM星形孢菌素（SS）处理4小时的HeLa细胞中TUNEL反应的荧光图像。 将细胞与反应混合物在37℃温育1小时。 使用具有FITC滤光器组的荧光显微镜分析绿色荧光信号。 荧光标记的DNA链断裂在SS处理的细胞中显示出强烈的荧光染色。

 

        多年来，TUNEL技术的几种变体已经针对各种生色和荧光检测形式进行了设计和优化。显色TUNEL检测非常适合我们的组织样本。 然而，荧光TUNEL测定被设计用于悬浮或贴壁细胞样品。几个变量影响TUNEL测定的染色动力学。这些变量中的一些包括试剂浓度，样品固定和DNA链断裂的可及性，其可在组织或细胞样品类型之间变化。 因此，使用阳性和阴性对照标准化您选择的TUNEL测定可以减轻这些潜在影响，从而减少检测错误信号的机会。 有关详细的说明，包括正负控制步骤，请参阅下面的TUNEL说明。

        用于检测DNA片段化的几种试剂盒是可商购的。由于竞争产品之间存在如此多的可能性和差异，因此选择合适的TUNEL分析可能会非常困难。为了帮助选择过程，我们推荐Cell Meter™TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，可提供绿色或红色荧光发射。这些绿色和红色TUNEL分析使用分别称为Tunnelyte™Green和Tunnelyte™Red的专有染料修饰的dUTP核苷酸。 Tunnelyte™Green在497 nm处的峰值吸收使其非常适合配备488 nm氩激光线的仪器进行激发。 虽然Tunnelyte™Red在556 nm处的峰值吸收被配备有氪离子激光器的仪器有效激发。 两种探针都与DNA染色染料如Hoechst（Cat＃17523），DAPI（Cat＃17511）或Nuclear Violet™LCS1（Cat＃17543）完全分离，从而制成任何合适的DNA复染染料。

        与其他商业上可获得的TUNEL分析相比，平均单价为45美元，平均单位为45次测试，Cell Meter™TUNEL分析提供价值，每个套件的价格为295美元，单位大小为50次。 此外，Cell Meter™TUNEL试剂盒中提供的反应缓冲液不含极其危险的砷化合物，二甲胂酸钠。 高度致癌和有毒的砷化合物使得来自其他供应商的tunel检测试剂盒极难被处理，储存和处理。

 

TUNEL分析方案（样品类型：贴壁或非贴壁细胞）

准备细胞培养：

1.根据您的具体方案，培养细胞以达到诱导细胞凋亡的密度。

对于在96孔微孔板培养物中生长的贴壁细胞，我们建议每孔约30,000至50,000个细胞。

对于非粘附细胞，我们建议约1至2 x 106个细胞/ mL。

2.同时，针对每种标记条件培养与诱导样品相同规格的非诱导阴性对照细胞群。

注意：对于使用HeLa细胞的样本，我们建议用100nM  - 1μM的星形孢菌素处理细胞4小时以诱导细胞凋亡。

 

固定和透化：

1.删除细胞培养基。

2.对于贴壁细胞，向每个孔中加入100μL/孔/ 96孔板的4％甲醛固定缓冲液。

注意：对于非粘附细胞，添加所需量，例如2 x 106个细胞/ mL的4％甲醛固定缓冲液。

3.在室温下孵育平板20至30分钟。

4.去除固定剂。

固定后渗透性的可选步骤：向每个孔中加入100μL/孔/ 96孔板的透化试剂，例如PBS中的0.2％Triton X-100，并在室温下孵育平板10分钟。

5.用PBS洗涤细胞2至3次。

任选的阳性对照步骤：为了制备TUNEL反应的阳性对照，在室温下用DNAse 1消化细胞30分钟，然后进行TUNEL反应。

 

TUNEL反应：

注意：在开始TUNEL反应之前，应对每个细胞系进行单独评估，以确定细胞密度。

1.根据待测样品的数量准备反应混合物：

将0.5μL100XTunnelyte Green加入50μL反应缓冲液中，总体积为50.5μL。

2.向每个样品中加入50μL新制备的反应混合物，并在37℃下孵育60分钟。

3.除去反应混合物，用200μL/孔的PBS将细胞处理3至5次。

4.使用荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 520nm处监测荧光强度。

可选：用1X Hoechst（组分C，Ex / Em = 350 / 460nm）对核进行图像分析