百萤实验：TF/TQ染料标记MMP和酪蛋白的肽序列及结果

材料和方法

所有肽均采用美国肽公司标准FMOC化学合成。一些TF肽是用FMOC-Lys（TF）-OH、FMOC-Asp（TF）-OH或FMOC-Glu（TF）-OH氨基酸制备的。在肽的标记中，用TF-NHS酯标记赖氨酸残基的N端氨基或ε-氨基。用TF马来酰亚胺或碘代乙酰胺标记巯基半胱氨酸残基。

TF1，TF2，TF3，TF4，TF5，TF6，TF7和TF8的酸、马来酰亚胺和NHS酯形式，以及FMOC-Lys（TF2-Boc）-OH，FMOC-Lys（TF3）-OH，FMOC-Asp（TF3）-OH，FMOC-Glu（TF3）-OH等均可从百萤生物获得。

所有的酶分析都是用从Sigma，R＆D Systems，EMD Chemicals购买的纯化酶完成的。使用用日立U-3010拍摄了吸收光谱，终点荧光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax（分子设备）上进行，酶动力学分析在FlexStation分子设备上进行）。

Tide Fluor （TF）染料的光谱特性

我们的TF系列荧光标记染料覆盖了整个可见光谱，具有非常高的标记效率。例如，TF2的光谱特性与AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理条件下或细胞内，它比荧光素亮3倍，耐光性高4倍。TF染料具有对pH4～pH10的pH波动不敏感的荧光，而FAM和FITC的荧光强度在同一范围内强烈依赖于pH值。

使用TF标记的FRET底物检测基质金属蛋白酶（MMP）活性

基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞外基质成分的降解，在细胞凋亡、胚胎发育、生殖组织重塑和修复中起重要作用。 百萤为大家筛选了以下基于TF的FRET底物，以检测MMP活性。

MMP活性的检测（续）

图1.以TF为基础的MMP底物与MMP-1（50units/ml）在室温下孵育15分钟。所有基质在5 uM的温度下使用，使用Sub#2的反应速度设定为 。用上表中分别列出的激发波长和发射波长测量荧光强度。

用TF标记酪蛋白底物检测通用蛋白酶活性

对各种蛋白酶活性的检测已成为许多生物实验室的常规任务。TF染料标记的酪蛋白缀合物被证明是广泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白被TF染料大量标记，导致了荧光猝灭。蛋白酶催化水解减轻了它的淬灭效应，产生荧光性很强的TF染料标记的肽段。TF染料标记肽荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。

图2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解图。 在室温下将3号底物与胰蛋白酶一起孵育。对照孔仅具有蛋白酶底物，而没有胰蛋白酶。 使用FlexStation从时间0（添加胰蛋白酶时）开始检测荧光信号。