AF532 酪胺（XFD532 tyramide）

染色样品示例

概述

      1.固定/透化/阻断细胞或组织

      2.在封闭缓冲液中加入一抗

      3.加入HRP标记的二抗

      4.准备酪胺工作溶液，室温下将其用于细胞或组织中5-10分钟

 

溶液配置

 

储备溶液配置

在没有额外说明的情况下，所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，制备后储存在-20°C。 避免反复冻融。

酪胺储备液（200X）

将100μLDMSO加入XFD532酪胺小瓶中，并充分混合。

注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下避光保存，避免反复冻融。

 

工作溶液配置

酪胺工作溶液（1X）

将100μL酪胺储备液加入20 mL含有0.003％H₂O₂的缓冲液中。

 注意：1. Tris Buffer，pH = 7.4更合适

            2. Tyramide工作溶液即用即配。

            3. 20 mL溶液可以进行200次测试。

 

实验方案

（本方案适用于细胞核组织染色）

细胞固定和透化

       1.在室温下，用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定细胞或组织20分钟。

       2.用PBS冲洗细胞或组织两次。

       3.在室温下，用0.1％Triton X-100溶液使细胞透化1-5分钟。

       4.用PBS冲洗细胞或组织两次。

 

过氧化物酶标记

       1.任选：将细胞或组织样本置于过氧化物酶淬灭液（如3%过氧化氢）中孵育10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下，用PBS冲洗两次。

       2.可选：如果使用HRP偶联的链霉抗生物素蛋白，建议通过生物素阻断缓冲液阻断内源性生物素。

       3.用封闭溶液（如含有1％BSA的PBS）在4℃下封闭30分钟。

       4.取出封闭溶液，加入稀释好的一抗，在室温下孵育60分钟或在4°C下孵育过夜。

       5.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

       6.向每个样品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室温下孵育60分钟。

         注意：孵育时间和浓度可根据信号强度而变化。

       7.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

 

酪胺标记

       1.准备100μL 酪胺工作溶液，将其应用于每个样品，并在室温下孵育5-10分钟。

        注意：如果您观察到非特异性信号，可以缩短酪胺的孵育时间。 您应使用不同孵育时间点的阳性和阴性对照样本，以优化孵育期。 或者您可以在工作溶液中使用较低浓度的酪胺。

        2.用PBS冲洗三次。

 

复染和荧光成像

       1.根据需要，对细胞或组织样本复染。 AAT提供了一系列细胞核复染试剂，如表1所列。按照试剂说明书进行操作。

        2.加上盖玻片。

        3.使用适当的滤波器观察酪胺标记的信号。

 

表1.推荐用于核复染的产品

货号	产品名称	Ex/Em(nm)
17548	Nuclear Blue DCS1	350/461
17550	Nuclear Green DCS1	503/526
17551	Nuclear Orange DCS1	528/576
17552	Nuclear Red DCS1	642/660