AF 532 C5马来酰亚胺 等同于 Alexa Fluor 532
Ex (nm) | 534 | Em (nm) | 553 |
分子量 | 812.88 | 溶剂 | DMSO |
存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
1.易于结合:可高效地标记蛋白质、抗体和寡核苷酸上的巯基
2.荧光明亮稳定:在pH 4-10范围内荧光不受影响且光稳定性好
3.亲水性好:减少聚集,提高信号清晰度,适用于成像应用和活细胞研究
适用范围
标记抗体、蛋白质、硫醇修饰的寡核苷酸
产品简介
AAT Bioquest 生产的XFD 532 C5马来酰亚胺是硫醇反应性染料,用于标记巯基。在pH 4-10范围内荧光不受影响且光稳定性好,是荧光成像、流式细胞术以及各种荧光分析技术的理想选择。
溶液配制
除非另有说明,否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等分,并在配制后储存在-20°C下。避免反复冻融。
1.蛋白质储备溶液(溶液A)
将100µL反应缓冲液(例如pH~6.0的100mM MES缓冲液)与900µL蛋白溶液(例如抗体,蛋白质浓度>2 mg/mL)混合,制成1mL蛋白质标记储备溶液。
注意:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为6.5±0.5。
注意:不纯的抗体或用牛血清白蛋白(BSA)或其他蛋白稳定的抗体不能很好地被标记
注意:蛋白质浓度低于2mg/mL,偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。
2.染料储备溶液(溶液B)
将无水DMSO加入XFD 532 C5 马来酰亚胺小瓶中,制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意:开始偶联之前准备染料储备溶液(溶液B)并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存4周。避免反复冻融。
3.可选
如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸,则必须用 DTT 或 TCEP 处理蛋白质生成硫醇基团。 DTT 或 TCEP 将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT,则必须在马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前,通过透析或凝胶过滤除去游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案:
1.在蒸馏水中制备 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鲜溶液。
2.在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液:混合时每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT储备液。在室温下静置 30 分钟,无需额外混合(以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。
3.将还原的 IgG 通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 馏分。
4.确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的组分合并。可以通过分光光度法或比色法来完成。
此步骤后尽快进行缀合(参见示例实验方案)。
注意: 为了获得好的结果,IgG 溶液得浓度应 >4 mg/mL。如果抗体低于 2 mg/mL,则应进行浓缩。另外,需要增加 10% 来补偿在缓冲液交换柱上的损失。
注意:还原反应可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行,例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液。
注意:步骤3和4可以用透析代替。
样品实验方案
(该方案适用于山羊抗小鼠IgG与XFD 532 C5 马来酰亚胺的偶联物标记。)
注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响,而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
进行偶联反应
1.使用10:1的摩尔比率(溶液B(染料)/A(蛋白质))作为起点:将5µL染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入蛋白质溶液(95µL溶液A)的小瓶中并充分摇晃。假设蛋白质浓度为10mg/mL,蛋白质分子量为~200KD,则蛋白质浓度为~0.05 mM。
注意:建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。如果太少或太高,可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。
2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联
(以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子)
1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。
2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。
3.当样品刚低于顶部树脂表面时,立即加入PBS(pH 7.2-7.4.)。
4.向样品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。
注意:如果需要立即使用,染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释,并分装。
注意:为了长期储存,染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
表征所需的染料-蛋白质缀合物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的关键因素。 DOS 较低的蛋白质通常荧光强度较弱,而 DOS 较高的蛋白质也可能荧光强度减弱。对于大多数抗体,建议最佳 DOS 在 2 到 10 之间,具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记,DOS 应控制为每摩尔抗体含有 5-8 摩尔 XFD532 C5 马来酰亚胺。以下步骤概述了如何确定 XFD532 C5 马来酰亚胺标记蛋白的 DOS。
检测吸收率
要测量染料-蛋白质缀合物的吸收光谱,请将样品浓度保持在 1 至 10 µM 之间。该范围内的确切浓度取决于染料的消光系数。
在 280 nm 处读取 OD(吸光度)和染料最大吸光度(对于 XFD532 C5 染料,ƛmax = 534 nm )
对于大多数分光光度计,用去离子水稀释样品(来自柱馏分),直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范围内。蛋白质的最佳吸光度为 280 nm,而 XFD532 C5 马来酰亚胺的最佳吸光度为 534nm。为了确保读数准确,请确保结合物不含任何非结合染料。
计算DOS
您可以通过以下链接使用我们的工具计算 DOS:https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator