Screen Quest 免洗Rhod-4钙检测试剂盒 去除培养基

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荧光酶标仪
Ex:	540 nm
Em：	590 nm
Cutoff：	570 nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式:	底部读取/分液处理

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞
2. 除去生长培养基
3. 添加Rhod-4 NW染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
4. 在室温下孵育1小时
5. 检测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

1. Rhod-4 NW储备溶液：将100 µL DMSO加入小瓶Rhod-4 NW（组分A）中并充分混合，避光。 注意：10 µL Rhod-4 NW储备液足以装满一块板。

2.分析缓冲液（1X）：a）对于＃36330（1个板试剂盒）和＃363331（10个板试剂盒），通过将9 mL HHBS（组分C）添加到10XPluronic®F127 Plus（1 mL，组分B）中来制成1X分析缓冲液，并充分混合。b）对于＃36332（100板试剂盒），通过向10XPluronic®F127 Plus（10 mL，组分B）中加入90 mL HHBS（未包括）制成1X Assay Buffer。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的1X分析缓冲液。 避光并避免重复的冻融循环。

 

工作溶液配制

Rhod-4 NW上色溶液：将10 µL Rhod-4 NW储备液添加到10 mL 1X分析缓冲液中，并充分混合。 注意：该工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

 

实验步骤

1.从细胞板中去除生长培养基。注意：重要的是去除生长培养基，以大程度地减少背景荧光和化合物对血清或培养基的干扰。或者，使细胞在含1-5％FBS的生长培养基中生长，以避免培养基去除步骤。在这种情况下，需要在HHBS缓冲液中添加2X染料。 [我们为在生长培养基中使用0.5-1％FBS以避免培养基去除步骤的人提供2个单独的免洗钙测定试剂盒（Cat.＃36334和Cat.＃36335）。

2.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Rhod-4 NW染料加载溶液添加到细胞板中。

3.在细胞培养箱中将染料加载板孵育30分钟，然后在室温下再孵育30分钟。注意：如果测定需要37°C，请立即进行实验，而无需进一步室温孵育。如果细胞在室温下能长时间正常工作，则在室温下孵育细胞板1-2小时。

4.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。

5.通过检测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度进行钙通量检测。

 

图示

图1.使用Screen Quest Rhod-4 NW分析试剂盒和Rhod-2 AM在HEK-293细胞中测量了卡巴胆碱剂量反应。 将HEK-293细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中过夜接种。 去除生长培养基，并使用Screen Quest Rhod-4 NW钙分析试剂盒将细胞与100 µL染料上样溶液或室温下100 µL Rhod-2 AM溶液（5 µM）孵育1小时。 NOVOstar（BMG Labtech）添加了卡巴胆碱（25 µL /孔）以达到指示的浓度。 使用Rhod-4 NW时卡巴胆的EC50约为0.8 µM。

 

 

参考文献

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