Screen Quest 免洗钾离子通道检测试剂盒

点击查看光谱

 

适用仪器

---

荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em：	520nm
cutoff:	510nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式:	底部读取模式/分液处理

样品实验方案

简要概述

1. 在生长培养基中准备细胞
2. 添加Tl-520 AM染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3. 在37°C孵育1小时
4. 加入激动剂/拮抗剂并在37°C下孵育30分钟
5. 加入Tl₂SO₄ / K₂SO₄刺激溶液（96孔板为50 µL /孔，384孔板为12.5 µL /孔）
6. 检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

1. TI-520 AM储备溶液：将20 µL（#36550）或DMSO（#36551和＃36552）的DMSO加到TI-520 AM（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：未使用的TI-520 AM储备溶液可以等分并存储在<-20℃下。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：将1 mL的10XPluronic®F127 Plus（组分B）添加到9 mL的HHBS缓冲液（组分C）中并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的10XPluronic®F127 Plus（组分B）。避光并避免重复的冻融循环。

3.无氯缓冲液（1X）：在8 mL的ddH₂O中加入2 mL的无氯缓冲液（5X）（组分D），并充分混合。

4. Tl₂SO₄溶液（未提供，Sigma Cat＃208191）：将Tl₂SO₄溶于超纯水中至终浓度80 mM。 注意：Tl₂SO₄有毒。 采取必要的预防措施，以防止吸入和皮肤接触。

 

工作溶液配制

1. TI-520 AM染料加载溶液：将20 µL TI-520 AM储备溶液（500X）加入10 mL的1X分析缓冲液中并充分混合。

2.刺激溶液（5X）：在1X无氯化物缓冲液中用Tl₂SO₄稀释配体（用于非电压门控钾通道）或K₂SO₄（用于电压门控钾通道）。

表1.应针对每个靶标优化参考（HEK293-KCNH₂细胞中的电压门控hERG通道），Tl₂SO₄和K₂SO₄（电压门控钾通道）或配体（非电压门控钾通道）的浓度及细胞类型。

组分	容积	5X 浓度	浓度
无氯缓冲液(5X)	2 mL
K2SO4 (250 mM)	1 mL	25 mM	5 mM
TI2SO4 (80mM)	0.5 mL	4 mM	0.8 mM
ddH2O	5.5 mL
总计:	10 mL

 

实验步骤

1.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的TI-520 AM染料加载溶液添加到细胞板中。

2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育1小时，然后在室温下再孵育15至30分钟。 注意：如果测定需要37°C，请立即进行实验，而无需进一步室温孵育。

3.用HHBS准备K⁺通道拮抗剂或激动剂。

4.在细胞培养箱中用拮抗剂（用于抑制研究）将板孵育30分钟。

5.用FLIPR，FDSS或Flexstation加50X /孔（对于96孔板）或12.5μL/孔（对于384孔板）的5X刺激缓冲液。 使用Ex / Em = 490/525 nm的滤光片组进行实验。 每1-2秒读取板3分钟。

 

图示

图1.使用Screen Quest 钾离子通道试剂盒在HEK293-KCNH2细胞中测量了对hERG通道的剂量依赖性抑制。 将细胞以20,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中接种过夜。 将细胞与100 µL染料加载溶液在37°C下孵育1小时。 向细胞中加入10 µL阿司咪唑，并在37°C下孵育30分钟。 通过FlexStation将50 µL含0.5 mM Tl2SO4和2.5 mM K2SO4的刺激溶液注入每个孔中，并在激发/发射= 490 / 525nm的情况下每秒钟读取3分钟。 IC50 = 0.46 µM。

图2.使用Screen Quest 钾离子通道试剂盒在HEK293-KCNH2细胞中测量了K2SO4剂量依赖性hERG通道活性。 将细胞以20,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中接种过夜。 将细胞与100 µL染料加载溶液在37°C下孵育1小时。 通过FlexStation将终浓度为1 mM，0.5 mM，0.25 mM或0 mM的Tl2SO4和不同浓度的含K2SO4的刺激溶液注入每个孔中，并在激发/发射= 490 /下每1-2秒读取平板3分钟。 525nm。