ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒

ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒是美国AAT Bioquest生产的生物素偶联试剂盒，生物素广泛用于标记生物分子，特别是抗体。 该试剂盒主要用于制备用于酶免疫测定（EIA）的生物素标记的IgG。 我们的试剂盒使用我们的ReadiView 生物素琥珀酰亚胺酯（＃3059），可与IgG和其他生物分子的氨基反应。 我们在试剂盒中包含的独特生物素带有用于指示生物素化程度的颜色标签，从而除了麻烦的HABA生物素化测定。 该试剂盒包含用于标记和纯化的所有必需试剂。 在我们的手中，使用我们的试剂盒可以将5至8个生物素分子与每个IgG分子缀合。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒。 

样品实验方案

简要概述

1.将5μl反应缓冲液（组分B）加入目标蛋白（50μl）中
2.将蛋白质溶液添加到ReadiView Biotin SE（组分A）中
3.在室温下孵育30-60分钟
4.通过旋转柱纯化缀合物

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
ReadiView Biotin SE原液配制：
将10μLDMSO（组分C）加入到ReadiView 生物素SE（组分A）的小瓶中，并剧烈涡旋。

注意：在开始缀合之前，准备ReadiView Biotin SE储备溶液（溶液B）。ReadiView Biotin SE原液的长期储存可能会降低生物素的活性。 溶液B可以在不受潮湿的情况下储存在冰箱中两周。 注意：将ReadiView Biotin SE原液分装到5个样品瓶（2μL/样品瓶）中。 标记100ug蛋白质只需要一个小瓶。 如果您需要重复结合，剩余的小瓶可以在冰箱中保存2周。

2.工作溶液配制

蛋白质工作溶液：
为了标记100μg靶蛋白（假设目标蛋白浓度为2 mg / mL），将5μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与50μL目标蛋白溶液混合。注意：如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~2 mg蛋白质可用于此标记反应。注意：蛋白质溶液的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用反应缓冲液（组分B）或饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至8.0-9.0的范围。注意：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。注意：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体可能效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得最佳标记结果。注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

操作步骤

1.进行结合反应

1.1将蛋白质工作溶液加入到ReadiView Biotin SE原液（2μL/小瓶）的小瓶中，通过反复移液几次将其充分混合，或者将小瓶涡旋2-5分钟。

1.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

2.准备旋转柱进行样品纯化

2.1将提供的旋转柱（组分D）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并除去任何气泡。

2.2取下尖端并将色谱柱放入洗涤管（2 mL，组分E）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心1分钟（参见“离心注释”部分）以除去包装缓冲液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。

3.纯化缀合物

3.1将色谱柱（从步骤准备旋转柱进行样品纯化）放入干净的收集管（1.5 mL，组分F）中。小心地将样品（20-100μL，来自步骤缀合反应）直接加载到色谱柱中心。

3.2加载样品后，加入1X PBS（pH 7.2-7.4）使总体积为110μL。将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需生物素标记蛋白的溶液。
蛋白质缀合物的储存

3.3抗体缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。当在2mM叠氮化钠存在下储存并且避光时，缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。为了更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-60℃下储存。

4.离心注意事项

4.1旋转柱（组分D）可以装入2mL微量离心管或12×75mm试管中，用于在离心过程中收集样品。使用2 mL微管和色谱柱进行初始色谱柱平衡步骤。

4.2能够产生1,000 x g的最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。或者，使用以下等式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。

4.3RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相对离心力，r是从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径，RPM是转子的速度）。

数据分析

图1.ReadiView 生物素与特殊设计的颜色标签（CT）结合，便于测定生物素化程度。

参考文献

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