PhosphoWorks 荧光法焦磷酸检测试剂盒 *蓝色荧光*

PhosphoWorks 荧光法焦磷酸检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测焦磷酸的试剂盒，焦磷酸盐（PPi）通过许多生化反应产生，例如ATP水解，DNA和RNA聚合，腺苷酸环化酶形成的环AMP和脂肪酸的酶促活化以形成它们的辅酶A酯。 我们的PhosphoWroks 焦磷酸盐检测试剂盒提供了强大的分光光度法测量焦磷酸盐。 该试剂盒使用我们专有的荧光焦磷酸盐，其荧光强度成比例地取决于焦磷酸盐的浓度。 我们的测定法比酶偶联焦磷酸盐方法更容易和更稳健，这些方法需要至少两种酶用于焦磷酸盐检测。 该试剂盒提供了测定焦磷酸盐的所有必需成分。 该试剂盒已成功用于高通量筛选（HTS）。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的PhosphoWorks 荧光法焦磷酸检测试剂盒。 

操作步骤

简要概述

准备焦磷酸盐标准品和/或测试样品（50μL）
加入焦磷酸盐工作溶液（50μL）
在室温下孵育10至30分钟
监测Ex / Em = 316/456 nm处的荧光强度（截止= 420 nm）

 

溶液制备

1.制备储存溶液

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 PPi探针储备溶液（200X）：
将50μLDMSO（组分D）加入到PPi探针（组分B）的小瓶中以制备200X PPi探针储备溶液。 避光。 注意：对于一个96孔板，25μLPPi探针储备溶液就足够了。

1.2焦磷酸盐标准溶液（1 mM）：
将10μL50mM焦磷酸盐标准品（组分C）加入490μLddH2 O或50mM Hepes缓冲液（pH 7）中，制成1mM焦磷酸盐标准溶液。

 

2.制备标准溶液

焦磷酸盐标准溶液制备
将50μL的1mM焦磷酸盐标准溶液加入到450μLDdH2O或50mM Hepes缓冲液中，得到100μM焦磷酸盐标准溶液（PS7）。 取100μM焦磷酸盐标准溶液，在ddH2O或50mM Hepes缓冲液中进行1：3连续稀释，得到连续稀释的焦磷酸盐标准品（PS6-PS1）。

 

3.制备工作溶液

将25μL的200X PPi Sensor储备溶液加入到5 mL的分析缓冲液（组分A）中并充分混合以制备PPi工作溶液。 注意：由于该检测方法对PPi具有高灵敏度，因此使用不含PPi的实验室器具和试剂非常重要。 DTT≥1mM会增加背景，MgCl2≥2mM会降低反应。

 

样品试验方案

表1.固体黑色96孔微孔板中焦磷酸盐标准品和测试样品的布局

PS =焦磷酸盐标准品（PS1-PS7,0.3至100μM），BL =空白对照，TS =测试样品

BL	BL	TS	TS
PS1	PS1	...	...
PS2	PS2	...	...
PS3	PS3
PS4	PS4
PS5	PS5
PS6	PS6
PS7	PS7

 

表2.每个孔的试剂组成

孔	规格	试剂
PS1-PS7	50ul	连续稀释液（0.3至100μM）
BL	50ul	分析缓冲液
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局制备焦磷酸盐标准品（PS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向焦磷酸盐标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLPPi工作溶液，使焦磷酸盐总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLPPi工作溶液，总体积为50μL/孔。 彻底混合试剂。

3.在室温下孵育10至30分钟。

4.用Ex / Em = 316 / 456nm（截止= 420nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

 

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（对照％）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算PPi，ATP，Pi样本。 我们建议使用在线四参数物流计算器，可在以下位置找到：

 

图1.使用PhosphoWorks Fluoremetric焦磷酸盐测定试剂盒在固体黑色96孔板中使用荧光酶标仪测量焦磷酸盐，ATP和磷酸盐剂量响应。

 

参考文献

RANKL Expression Is Increased in Circulating Mononuclear Cells of Patients with Calcific Aortic Stenosis
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Host-Pathogen Interaction and Signaling Molecule Secretion Are Modified in the dpp3 Knockout Mutant of Candida lusitaniae
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