PhosphoWorks 荧光法ADP检测试剂盒 *红色荧光*

PhosphoWorks 荧光法ADP检测试剂盒 *红色荧光*是美国AAT Bioquest生产的用于检测ADP的试剂盒，ADP参与许多生物反应，例如蛋白激酶。 我们的ADP分析试剂盒可通过监测ADP的形成来普遍用于分析蛋白激酶反应，而ADP的形成与酶磷酸转移酶的活性成正比，并通过荧光法进行测量。 该试剂盒提供了一种快速，简单且均一的测定ADP形成或消耗的测定方法。 该测定是连续的，并且可以容易地适于自动化。 该套件很方便，需要少的动手时间。 由于蛋白激酶与诸如癌症和其他增生性疾病，炎性疾病，代谢紊乱和神经系统疾病等疾病的广泛相关性，因此参与药物开发的研究人员对蛋白激酶很感兴趣。 大多数商业化的蛋白激酶检测试剂盒都是基于对磷酸肽形成或ATP缺失的监测。 我们的ADP检测试剂盒比大多数商业激酶检测试剂盒对蛋白质激酶的检测更稳定。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的PhosphoWorks 荧光法ADP检测试剂盒 *红色荧光*。

样品实验方案

简要概述

1.运行激酶反应（20 µL）
2.添加ADP传感器缓冲液（20 µL）
3.添加ADP传感器（10 µL）
4.在室温下孵育15分钟-1小时
5.检测荧光强度

 

溶液制备

1.储备溶液制备

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1ADP Sensor I库存解决方案（50X）：
将20 µL DMSO（组分B3）添加到ADP探针I（组分B1）的小瓶中。

1.2ADP探针储备溶液（1X）：
将20 µL 50X ADP Sensor I储备溶液添加到ADP Sensor II（组件B2）的小瓶中。

1.3ADP标准溶液（300 mM）：
将100 µL H2O加入ADP标准液（组分C）中，制成300 mM ADP储备液。

 

2.标准溶液

ADP标准
通过包括不含ADP的样品来测量背景荧光，在激酶反应缓冲液中进行ADP标准品的系列稀释。 注意：通常，ADP浓度范围为0.05至30 µM是合适的。

 

样品示例及操作

表1.黑色96孔微孔板中ADP标准品和测试样品的布局。 SD = ADP标准（SD1-SD7，0.05至30 uM）; BL =空白对照； TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
SD1	SD1	...	...
SD2	SD2	...	...
SD3	SD3
SD4	SD4
SD5	SD5
SD6	SD6
SD7	SD7

表2.每个孔的试剂组成。

孔	容积	试剂
SD1-SD7	20ul	连续稀释（0.05至30 µM）
BL	20ul	ADP分析缓冲液
TS	20ul	激酶反应

1.运行激酶反应（此步骤未提供试剂）：

1.1根据需要准备20 µL激酶反应溶液。激酶反应的成分应根据需要进行优化（例如，特定的激酶反应可能需要优化的缓冲液系统）。在大多数情况下，如果您没有优化的激酶缓冲液，也可以使用ADP分析缓冲液（组分D）进行激酶反应。

1.2Amplite 荧光ADP测定试剂盒用于确定ADP的形成。在DTT和β-巯基乙醇等硫醇存在下，ADP传感器不稳定。终硫醇浓度高于10 µM会大大降低测定的动态范围。

2.运行Amplite ADP分析：

2.1向装有20 µL激酶反应溶液的每个孔中加入20 µL ADP传感器缓冲液（组分A）和10 µL ADP Sensor储备溶液，使ADP测定总体积为50 µL /孔。注意：在DTT和β-巯基乙醇等硫醇存在下，ADP传感器不稳定。终硫醇浓度高于10 µM会大大降低测定的动态范围。注意：ADP分析应在6.5至7.4的pH值下进行。

2.2将反应混合物在室温下孵育15分钟至1小时。

2.3使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540/590 nm处监控荧光强度。

 

参考文献

Discovery of Non-ATP-Competitive Inhibitors of Polo-like Kinase 1
Authors: Taikangxiang Yun, Tan Qin, Ying Liu, Luhua Lai
Journal: ChemMedChem (2016): 713--717

Cell polarity kinase MST4 cooperates with cAMP-dependent kinase to orchestrate histamine-stimulated acid secretion in gastric parietal cells
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Regulation of NDR1 activity by PLK1 ensures proper spindle orientation in mitosis
Authors: Maomao Yan, Lingluo Chu, Bo Qin, Zhikai Wang, Xing Liu, Changjiang Jin, Guanglan Zhang, Marta Gomez, Alexander Hergovich, Zhengjun Chen
Journal: Scientific reports (2015): 10449

Trypanosoma brucei vacuolar transporter chaperone 4 (TbVtc4) is an acidocalcisome polyphosphate kinase required for in vivo infection
Authors: Noelia Lander, Paul N Ulrich, Roberto Docampo
Journal: Journal of Biological Chemistry (2013): 34205--34216

 

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