Peko Green双链核酸染料

Peko Green 染料是一种新型的dsDNA染料。其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA。检测范围宽，可跨越4个数量级。特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐，尿素，已醇，氯仿，去垢剂，蛋白等干扰。对微量的双链DNA进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要。例如cDNA文库的构建，亚克隆的DNA片段的纯化，定量DNA扩增产物，在药物中DNA分子残留的测定等。检测核酸浓度最常用的方法就是检测核酸在260nm (A260)处的光吸收，此方法主要的缺点是单链核酸和单核苷酸会产生干扰信号，核酸样品中的杂质也会影向结果。光吸收不能区分DNA和RNA，灵敏度也相对较低（用1cm的比色杯在A260值为0.1时相对应的双链DNA浓度为5μg/mL）。目前使用Peko Green 染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测。

实验方法

1.试剂准备

Peko Green是以1毫升的浓缩液形式保存在无水DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制2x Peko Green试剂的工作溶液,用1xTE液（10mM的Tris-HCl，1mM EDTA中，pH值为7.5）按1:200的比例稀释浓缩液。如果要准备好足够的工作液检测20个样品，可在20毫升1xTE加入100μL Peko Green dsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在一个塑料容器中配制。Peko Green试剂容易光降解，所以应将配好的溶液用箔包主或放置暗处避光保存。溶液最好在配制数小时内使用，以保证最佳结果。

2.DNA标准曲线

2.1 标准品工作液的配制：

Sigma小牛胸腺DNA干粉（货号：D4522-1MG）1mg (Tris, NaCL等浓度已成标准体系)，加入1mL双蒸水，配制成1mg/mL的标准工作液。

2.2 标准品工作液的稀释：

母液稀释：取10mL(1mg/mL) 标准品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀释成10μg/mL。再取10μL（10mg/mL）标准品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀释成100ng/mL。

倍比稀释：取800μL(100ng/mL) 标准品工作液加入到200 μLTE溶液中，稀释成80ng/mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在。25-80ng/mL范围线性较好，此方法DNA检出限为0.3ng/mL）。再取500mL（80ng/mL）标准品工作液加入到500 mLTE溶液中，浓度稀释到40ng/mL。然后按倍比稀释成20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL的标准品溶液，见表1。

表 1标准品工作液及样品排续在一个实心的黑色96孔板*

*备注: DS= 标准品工作液从0到40ng/mL平行样品

3.双链DNA样品分析

3.1倍比稀释后的各梯度标准品溶液，样品，和染料工作液各取100μL混匀，避光室温放置5分钟见表1。

备注: 如果用 384孔板, 则倍比稀释后的各梯度标准品溶液，样品，和染料工作液各取25mL即可。

3.2用荧光酶标仪在激发/发射波长= 490/525 nm（截止波长为510 nm）检测荧光强度。

3.3样品DNA 含量可根据标准品曲线算出。