藻红蛋白RPE CAS 11016-17-4

产品货期

现货

产品优势  

1.长波长发射曲线有效减少了生物材料的自发荧光

2.藻胆素与蛋白质骨架共价结合，对荧光淬灭的影响极小

3.高的水溶性，便于进行结合反应的化学操作 

4.显著的Stokes位移和可解析的发射光谱，适用于流式多色分析

5.多个位点可与抗体、花菁染料或iFluor染料等有机和合成化合物稳定结合

6.用于多色流式细胞术的串联染料——通过单一激发光产生一系列发射信号

适用范围

主要用于标记抗体

注意事项

1.需要纯化，除去硫酸铵 

纯化步骤：①离心；②去掉上清液；③使用PBS溶解沉淀；④使用脱盐柱纯化；⑤浓缩；

2.需要活化，使其可以标记到抗体上（将PE与SMCC反应，使它们带有马来酰亚胺基团）

产品介绍

R-藻红蛋白（PE）是从红藻中分离出来的。其主要吸收峰位于565nm，次要吸收峰位于496和545nm。不同类型的R-PE之间次级峰的相对突出程度存在明显差异。PE有三种类型的亚基：α（20000daltons）、β（20000daltons）和γ（30000daltons），PE的α亚基仅含有藻红蛋白（PEB）发色团，而β和γ亚基同时含有PEB和藻胆蛋白（PUB）。不同类型PE吸收光谱的可变性反映了亚基PEB/PUB比值的差异。PE和与B-PE是最强烈的荧光藻胆蛋白，量子效率可能超过90%，在任何中等浓度的溶液中，其橙色荧光都很容易被肉眼看到。

通常，当作为硫酸铵沉淀物冷藏储存时，藻胆蛋白具有良好的长期稳定性。纯化的胆脂蛋白可以在酸性或碱性条件下解离成亚基，但在室温下在中性pH下相对稳定，浓度大于0.1mg / mL。解离的亚基通常比天然色素的着色和荧光更低。建议将所有藻胆蛋白及其结合物（优选在中性缓冲溶液中）冷藏保存。

PE偶联抗体的详细参考步骤：PE conjugation of antibodies (drmr.com)

PE与抗体的缀合实验方案

注1：整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对PE的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml 的抗体溶液。请您在进行PE抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2：SMCC-PE缀合物非常稳定（在“交换缓冲液”中，在 4C 下至少可以稳定几个月）。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 PE，并将其用于几次抗体实验（在几周内）。SMCC-PE 的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一.PE的制备

1.将 PE 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10 mg/ml。注意：PE 在缀合前作为 SAS（硫酸铵钠）沉淀物最稳定。如果将 PE 以 SAS 沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2.使用3.5毫克R-PE修饰每毫克IgG，包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查 PE 的纯度和浓度，请测量 280、565 和 620 nm 处的吸光度。（1 mg/ml 的 PE 在 565nm 处的 OD 为 8.2）。565/620 比率 > 50 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。

二.PE的活化

1.使用前在无水 DMSO 中制备 10 mg/ml 的 SMCC 储备溶液。

2.每毫克 PE 加入 11 µl SMCC，并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转 60 分钟。

3.将纯化的 PE 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC 相对于 PE 的量，可能会有所好转。

三.IgG还原

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT (15.4 mg/100 µl) 的新鲜溶液。

2.IgG 溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和 TRIS 缓冲液（pH 范围为 6 至 8）已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加 10%。

3.用 DTT 配制 20 mM IgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20 µl DTT 原液并搅拌。室温下静置 30 分钟，无需额外搅拌（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

4.将还原的IgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分IgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。

四.进行缀合

1.每毫克 IgG 添加 3.2 毫克 SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转 60 分钟。

注意：这些摩尔比（每 IgG 约 2 个 PE）效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60 分钟后，必须去掉 IgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克 IgG 添加 34 µg (3.4 µl)。室温下包裹并旋转 20 分钟。

试剂应用文献