D-荧光素钾盐 CAS 115144-35-9

D-荧光素是流行的多功能生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫（Photinus pyralis）和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂环丁酮中间体氧化ATP进行活化荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的ATP依赖性氧化产生光。来自该反应的560nm化学发光在数秒内达到峰值，当荧光素和ATP过量存在时，光输出与荧光素酶活性成比例。萤火虫荧光素酶长期以来与抗体结合，并在荧光素作为检测底物的免疫测定中用作标记物。与HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶对化学修饰的耐受性较差。该酶的一个特别优点是除了其高灵敏度之外，在哺乳动物组织中存在低内源荧光素酶活性。荧光素酶的另一个重要用途是卫生监测领域，荧光素酶/荧光素系统可用于检测污染，因为存在于所有生物体中的ATP需要发光，这种ATP生物发光的主要应用是通过测试食品加工厂中的表面来确定质量，以确定是否存在设备或产品的污染。D-荧光素 钾盐 D-Luciferin 是美国AAT Bioquest 的产品。

注：一般活体用DPBS，避免渗透压影响。体外细胞一般用无菌水，避免盐粒子影响信号通路级联反应，尤其是钙信号。

注：该产品用DPBS溶解后，如果需要保存，请调整如下浓度及pH保存：100 mM, pH ~6.5, -20℃避光。pH过高，可能会导致染料失效。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。 如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。

Luc的Ex/Em及其他相关内容链接：Spectral properties of luciferin and EGFP. A: Normalized excitation and... | Download Scientific Diagram (researchgate.net)

D-荧光素钾盐及D-荧光素使用中的常见问题

百萤问号：荧光素酶到底该如何检测？

操作方法 

以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。

1.用于体外生物发光图像测定的实施方案

1.1在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。混合均匀。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

1.2在预热的组织培养基中制备0.5-1mM D-荧光素的工作溶液。

1.3从培养细胞中分离培养基。

1.4将荧光素工作溶液加入细胞中，并在成像前将细胞在37°C孵育5-10分钟。

2.用于体内生物发光图像测定的实施方案

2.1在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液，不含Mg²⁺和Ca²⁺。 混合均匀。

2.2过滤器通过0.2μm过滤器过滤溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

2.3在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像前10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。

注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。

3.荧光素报告分析分子测定的实施方案

3.1在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

3.2制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。

3.3将5-10μl细胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。

3.4根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液对光度计进行预调。

3.5注入200μl荧光素工作溶液，无延迟，10秒积分时间。

注：积分时间（integration time）是指在光学测量中，仪器收集光信号并累积的时间长度。这个时间越长，仪器能够收集到的光信号就越多，从而提高测量的灵敏度和准确性。在荧光素实验中，10秒的积分时间意味着仪器在这10秒内不断收集并累积光信号，然后将其用于分析。

注意1：D-荧光素钾盐溶于无菌水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并在-20°C下避光储存。必须用适当的碱中和游离酸溶解。

注意2：D-荧光素可与任何现有的文献或ATP分析系统一起使用。

注意3：如果检测ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。仅使用无菌无ATP水和试剂。使用高压水进行所有试剂制备。

试剂应用文献

Bioluminescence imaging of Arc expression in mouse brain under acute and chronic exposure to pesticides
Authors: Izumi, Hironori and Ishimoto, Tetsuya and Yamamoto, Hiroshi and Mori, Hisashi
Journal: NeuroToxicology (2018)

参考文献

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