Cy5.5 双NHS酯

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产品优势

1.水溶性好

2.消光系数高

3.摩尔吸收率大

4.高特异性和灵敏度

适用范围

用于标记肽、蛋白和寡核苷酸

产品介绍

AAT Bioquest生产的Cy5.5双NHS酯具有两个NHS基团，是胺反应性染料，用于标记氨基。常被用于生物分子标记，荧光成像及其他荧光生物分析。 Cy5.5染料在与蛋白质结合后荧光增强。

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溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等分，并在配制后储存在-20°C下。避免反复冻融。

1.蛋白质储备溶液（溶液A）

将100µL反应缓冲液（例如1 M 碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸缓冲液）与900µL蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白质标记储备溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1 M碳酸氢钠溶液或pH 9.0的1M磷酸盐缓冲液将pH值调整到8.0-9.0的范围内。

注意：蛋白质应溶解在pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH 7.2-7.4的1X PBS透析，以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。

注意：不纯的抗体用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不能很好地被标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应，可以通过透析或旋转柱去除，达到更好的标记结果。

注意：蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。

2.染料储备溶液（溶液B）

将无水DMSO加入Cy5.5双NHS酯小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存两周。避免反复冻融。

样品实验方案
（该方案适用于山羊抗小鼠IgG与Cy5.5双NHS酯的偶联物标记。）

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

进行偶联反应

1.使用10:1的摩尔比率（溶液B（染料）/A（蛋白质））作为起点：将5µL染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入蛋白质溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分摇晃。蛋白质浓度为10mg/mL，假设蛋白质分子量为~200KD，则蛋白质浓度为~0.05 mM。

注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联

（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）

1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.）。

4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。

注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

试剂应用文献

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