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Cy3 NHS酯,钾盐

英文名称:Cyanine 3 monosuccinimidyl ester, potassium salt [same as GE Cy3® NHS ester]
产品参数
Ex (nm)555Em (nm)569
分子量765.93溶剂DMSO
存储条件在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

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产品优势

1.水溶性好

2.消光系数高

3.摩尔吸收率大

4.高特异性和灵敏度

 

适用范围

用于标记肽、蛋白和核酸

 

产品介绍

AAT Bioquest生产的Cy3 NHS酯,钾盐与GE的Cy3NHS酯相同,是胺反应性染料,用于标记氨基。常被用于生物分子标记,荧光成像及其他荧光生物分析。Cy3染料在与蛋白质结合后荧光大幅度增强。

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实验方案

溶液配制

除非另有说明,否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等分,并在配制后储存在-20°C下。避免反复冻融。

 

1.蛋白质储备溶液(溶液A)

将100µL反应缓冲液(例如1 M 碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸缓冲液)与900µL蛋白溶液(例如抗体,蛋白质浓度>2 mg/mL)混合,制成1mL蛋白质标记储备溶液

注意:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0,则使用1 M碳酸氢钠溶液或pH 9.0的1M磷酸盐缓冲液将pH值调整到8.0-9.0的范围内。

注意:蛋白质应溶解在pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH 7.2-7.4的1X PBS透析,以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(如硫酸铵和乙酸铵)。

注意:不纯的抗体用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的抗体不能很好地被标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应,可以通过透析或旋转柱去除,达到更好的标记结果。

注意:蛋白质浓度低于2mg/mL,偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。


2.染料储备溶液(溶液B)

将无水DMSO加入Cy3NHS酯,钾盐小瓶中,制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意:开始偶联之前准备染料储备溶液(溶液B)并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存两周。避免反复冻融。

 

样品实验方案
(该方案适用于山羊抗小鼠IgG与Cy3NHS酯,钾盐的偶联物标记
。)

注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响,而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

 

进行偶联反应

1.使用10:1的摩尔比率(溶液B(染料)/A(蛋白质))作为起点:将5µL染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入蛋白质溶液(95µL溶液A)的小瓶中并充分摇晃。假设蛋白质浓度为10mg/mL,蛋白质分子量为~200KD,则蛋白质浓度为~0.05 mM。

注意:建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。如果太少或太高,可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。


纯化偶联

(以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子)

1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3.当样品刚低于顶部树脂表面时,立即加入PBS(pH 7.2-7.)。

4.向样品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

注意:如果需要立即使用,染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释,并分装。

注意:为了长期储存,染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

试剂应用文献

LLPS of FXR proteins drives replication organelle clustering for $\beta$-coronaviral proliferation
Authors: Li, Meng and Hou, Yali and Zhou, Yuzheng and Yang, Zhenni and Zhao, Hongyu and Jian, Tao and Yu, Qianxi and Zeng, Fuxing and Liu, Xiaotian and Zhang, Zheng and others,
Journal: Journal of Cell Biology (2024)
 
Competitive binding-mediated mesoscale protein-protein interactions direct microtubule growth
Authors: Wei, Zhiyi and Jia, Xuanyan and Lin, Leishu and Guo, Siqi and Zhou, Lulu and Jin, Gaowei and Dong, Jiayuan and Xiao, Jinman and Xie, Xingqiao and Li, Yiming and others,
Journal: (2024)
 
An ULK1/2-PXN mechanotransduction complex suppresses breast cancer cell migration
Authors: Liang, Peigang and Zhang, Jiaqi and Wu, Yuchen and Zheng, Shanyuan and Xu, Zhaopeng and Yang, Shuo and Wang, Jinfang and Ma, Suibin and Xiao, Li and Wu, Tianhui and others,
Journal: bioRxiv (2023): 2023--02
 
A liquid-to-solid phase transition of Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) initiated by oxidation and disease mutation
Authors: Gu, Siyu and Xu, Ming and Chen, Long and Shi, Xiangyan and Luo, Shi-Zhong
Journal: Journal of Biological Chemistry (2022): 102857
 
Promotion of row 1--specific tip complex condensates by Gpsm2-G$\alpha$i provides insights into row identity of the tallest stereocilia
Authors: Shi, Yingdong and Lin, Lin and Wang, Chao and Zhu, Jinwei
Journal: Science Advances (2022): eabn4556