Cy7 酪胺（Cy7 tyramide）

样品染色示例

概述

1.固定/透化/阻断细胞或组织

2.在封闭缓冲液中加入一抗

3.加入HRP标记的二抗

4.准备酪胺工作溶液，在室温下在细胞或组织中施用5-10分钟

 

溶液配制

在没有额外说明的情况下，所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C，避免反复冻融。

制备储存溶液

Tyramide原液（1000X）加入适量的DMSO，制成1-5mM的酪胺储备液。

制备工作溶液

Tyramide工作溶液（1X）

将1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的缓冲液中。

注意：1.Tris Buffer，pH = 7.4更合适。
           2.Tyramide工作溶液应立即使用。

 

实验方案

（该方案适用于细胞和组织染色。）

 

细胞固定和透化

1.在室温下用PBS中的3.7％甲醛或多聚甲醛固定细胞或组织20分钟。

2.用PBS冲洗细胞或组织两次。

3.在室温下用0.1％Triton X-100溶液使细胞透化1-5分钟。

4.用PBS冲洗细胞或组织两次。

过氧化物酶标记

1.任选：在过氧化物酶淬灭溶液（例如3％过氧化氢）中孵育细胞或组织样品10分钟，淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下用PBS冲洗两次。

2.可选：如果使用HRP偶联的链霉抗生物素蛋白，建议通过生物素阻断缓冲液阻断内源性生物素。

3.用优选的封闭溶液（例如含有1％BSA的PBS）在4℃下封闭30分钟。

4.取出封闭溶液，加入在推荐抗体稀释液中稀释的一抗在室温下60分钟或在4°C下过夜。

5.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

6.向每个样品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室温下孵育60分钟。

注意：孵育时间和浓度可根据信号强度而变化。

7.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

 

酪胺标记

1.为每个样品准备并应用100μL酪胺工作溶液，并在室温下孵育5-10分钟。

注意：如果您观察到非特异性信号，则可以缩短Styramide的孵育时间。您应该在不同的孵育时间点使用阳性和阴性对照确定样品的孵育时间，或者您可以在工作溶液中使用较低浓度的Styramide。。

荧光成像

1.根据需要对细胞或组织样本进行计数。AAT提供了一系列细胞核复染试剂，如表1所列。按照试剂提供的说明进行操作。

2.加上盖玻片。

3.使用适当的过滤器观察酪胺荧光信号。

表1.推荐用于核复染的产品

货号	产品名称	Ex/Em(nm)
17548	Nuclear Blue DCS1	350/461
17550	Nuclear Green DCS1	503/526
17551	Nuclear Orange DCS1	528/576
17552	Nuclear Red DCS1	642/660