Cy3 酪胺（Cy3 tyramide）

       1.在室温下，用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定细胞或组织20分钟。

       2.用PBS冲洗细胞或组织两次。

       3.在室温下，用0.1％Triton X-100溶液使细胞透化1-5分钟。

       4.用PBS冲洗细胞或组织两次。

       1.可选：将细胞或组织样本置于过氧化物酶淬灭液（如3%过氧化氢）中孵育10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下，用PBS冲洗两次。

       2.可选：如果使用HRP偶联的链霉抗生物素蛋白，建议通过生物素阻断缓冲液阻断内源性生物素。

       3.用封闭溶液（如含有1％BSA的PBS）在4℃下封闭30分钟。

       4.取出封闭溶液，加入稀释好的一抗，在室温下孵育60分钟或在4°C下孵育过夜。

       5.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

       6.向每个样品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室温下孵育60分钟。

         注意：孵育时间和浓度可根据信号强度而调整。

       7.用PBS洗涤三次，每次5分钟。

         1.准备100μL 酪胺工作溶液，将其应用于每个样品，并在室温下孵育5-10分钟。

        注意：如果您观察到非特异性信号，可以缩短酪胺的孵育时间。 使用不同孵育时间点的阳性和阴性对照样本，以优化孵育期。 或者在工作溶液中使用较低浓度的酪胺。

        2.用PBS冲洗三次