Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合微孔板检测

Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合微孔板检测 是美国AAT Bioquest研发的用于检测线粒体膜电位的试剂盒，JC-1在许多实验室中被广泛使用，但其水溶性差导致大的不便。即使在1μM浓度下，JC-1也倾向于在水性缓冲液中沉淀。当需要高染料浓度时，JC-10被开发成为JC的优异替代品。与JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性。 JC-10能够选择性地进入线粒体，并随着膜电位的增加可逆地将其颜色从绿色变为橙色。该性质是由于膜极化时JC-10聚集体的可逆形成导致发射光从520nm（即JC-10单体形式的发射）向570nm（即J-聚集体形式的发射）的移动。当在490nm处激发时，随着线粒体膜变得更加极化，JC-10的颜色从绿色橙色可逆地变为绿色橙色。使用通常安装在所有流式细胞仪中的过滤器可以检测两种颜色。可以在荧光通道1（FL1）中分析绿色发射，在通道2（FL2）中分析绿色橙色发射。除了用于流式细胞仪外，它还可用于荧光成像和荧光微孔板平台。这种Cell Meter 线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了强大的检测方法。

这种Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了可靠的检测方法。该试剂盒基于阳离子亲脂性JC-10染料检测细胞中线粒体膜电位的变化。在正常细胞中，JC-10浓缩在线粒体基质中，在那里形成红色荧光聚集体。然而，在凋亡和坏死细胞中，JC-10扩散出线粒体。它变成单体形式并以绿色荧光染色细胞。该试剂盒可用于筛选凋亡抑制剂。可以以方便的96孔和384孔荧光微量滴定板形式进行测定。百萤生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的线粒体膜电位荧光探针。

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96孔板样品分析

概述

准备细胞

添加测试化合物

添加JC-10染料加载溶液（50μL/孔/ 96孔板或12.5μL/孔/ 384孔板）

在37℃，5％CO2培养箱中孵育30至60分钟

添加测定 缓冲液B（50μL/孔/ 96孔板或12.5μL/孔/ 384孔板）

在Ex / Em = 490/525和540/590 nm处监测荧光强度

 

操作步骤

1.准备细胞：
1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞以20,000至80,000个细胞/孔/90μL过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/20μL，用于384孔板。
1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于100,000-200,000细胞/孔/90μL的培养基中，用于96孔poly-D赖氨酸平板或25,000-50,000细胞/孔 /20μL，用于384孔聚-D赖氨酸板。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的佳细胞密度。

 

2.准备JC-10染料加载溶液：
2.1使用前在室温下清洗所有套件组件。
2.2将50μL100XJC-10（组分A）加入5mL测定缓冲液A（组分B）中，充分混合。
注意：将未使用的100X JC-10（组分A）等分并保存在-20 oC。 避免反复冻/融循环。

 

3.运行JC-10测定：
3.1通过向所需缓冲液（例如PBS或HHBS）中加入10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）来处理细胞。
注意：在添加化合物之前不必洗涤细胞。然而，如果测试的化合物对血清敏感，则可在添加化合物之前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后将相同体积的HHBS添加到孔中（例如对于96孔板为90μL或对于384孔板为20μL）。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。
3.2在室温或37℃，5％CO2培养箱中培养细胞板至少15分钟或所需的时间（对于Jurkat细胞，用喜树碱4-6小时或用星形孢菌素处理3-5小时）到诱导细胞凋亡
3.3将50μL/孔（96孔板）或12.5μL/孔（384孔板）的JC-10染料加载溶液（来自步骤2.2）加入细胞板（来自步骤3.2）。
3.4将染料加载板在37℃，5％CO2培养箱中孵育30-60分钟，避光。
注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
3.5在读取荧光强度之前，将50μL/孔（96孔板）或12.5μL/孔（384孔板）的测定缓冲液B（组分C）加入染料加载板（来自步骤3.4）。
注1：装载后请勿清洗电池。
注2：对于非粘附细胞，建议在加入分析缓冲液B（组分C）后，以800rpm离心细胞板2分钟，同时停止制动。
3.6使用底部读取模式监测Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm处截止）和540 / 590nm（在570nm处截止）的荧光强度以进行比率分析。

 

数据分析

Em在525/590处的荧光强度比率用于数据分析。

图1.在Jurkat细胞中用JC-10和JC-1测量了喜树碱诱导的线粒体膜电位变化。 用喜树碱（10mM）处理Jurkat细胞4小时后，向孔中加入JC-1和JC-10染料上样溶液并孵育30分钟。 使用NOVOstar酶标仪（BMG Labtech）在Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm下测量J-聚集体和单体形式的JC-1和JC-10的荧光强度。

 

参考文献

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