Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合流式细胞检测

Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合流式细胞仪检测 是美国AAT Bioquest研发的用于检测线粒体膜电位的试剂盒，JC-1在许多实验室中被广泛使用，但其水溶性差导致大的不便。即使在1μM浓度下，JC-1也倾向于在水性缓冲液中沉淀。当需要高染料浓度时，JC-10被开发成为JC的优异替代品。与JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性。 JC-10能够选择性地进入线粒体，并随着膜电位的增加可逆地将其颜色从绿色变为橙色。该性质是由于膜极化时JC-10聚集体的可逆形成导致发射光从520nm（即JC-10单体形式的发射）向570nm（即J-聚集体形式的发射）的移动。当在490nm处激发时，随着线粒体膜变得更加极化，JC-10的颜色从绿色橙色可逆地变为绿色橙色。使用通常安装在所有流式细胞仪中的过滤器可以检测两种颜色。可以在荧光通道1（FL1）中分析绿色发射，在通道2（FL2）中分析绿色橙色发射。除了用于流式细胞仪外，它还可用于荧光成像和荧光微孔板平台。这种Cell Meter 线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了强大的检测方法。

这种Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了可靠的检测方法。该试剂盒基于阳离子亲脂性JC-10染料检测细胞中线粒体膜电位的变化。在正常细胞中，JC-10浓缩在线粒体基质中，在那里形成红色荧光聚集体。然而，在凋亡和坏死细胞中，JC-10扩散出线粒体。它变成单体形式并以绿色荧光染色细胞。该试剂盒可用于筛选凋亡抑制剂。可以以方便的96孔和384孔荧光微量滴定板形式进行测定。百萤生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的线粒体膜电位荧光探针。

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96孔板样品分析

概述

用密度为5×10⁵到1×10⁶个细胞/ mL的测试化合物制备细胞

用500μL1XJC-10染料加载溶液重悬细胞（2-5×10⁵细胞/管）

37°C孵育/ 室温15-30分钟

用流式细胞仪分析FL1通道（绿色荧光单体信号）和FL2通道（橙色荧光聚合信号）

 

操作方法

1.准备细胞：
以5×10⁵至1×10⁶个细胞/ mL的密度制备细胞。
注意：应根据个体评估每个细胞系，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

 

2.准备JC-10染料加载溶液：
2.1使用前在室温下清洗所有试剂盒中的试剂。
2.2将25μL的200X JC-10（组分A）加入5mL的测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：将未使用的200X JC-10（组分A）等分并保存在-20℃。 避免反复冻/融循环。

 

3.运行JC-10测定：
3.1用测试化合物细胞培养所需的一段时间以诱导细胞凋亡。设置并行控制实验。
对于阴性对照：仅用载体处理细胞。
对于阳性对照：在37℃，5％CO₂培养箱中用2-10μM的FCCP或CCCP处理细胞15至30分钟。
注意：CCCP或FCCP可与JC-10染料加载溶液同时添加（来自步骤2.2）。可能需要滴定CCCP或FCCP以获得具有单个细胞系的结果。
3.2离心细胞，每管2-5×10⁵个细胞。
注意：对于贴壁细胞，用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞摄入，用含有血清的培养基洗涤细胞一次，然后用JC-10染料加载溶液孵育（参见步骤3.3）。
3.3在500μLJC-10染料加载溶液中重悬细胞（来自步骤2.2）。
3.4在室温下或在37℃，5％CO₂培养箱中孵育染料装载细胞15-60分钟，避光。
注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
3.5通过在FL1通道中使用流式细胞仪检测荧光强度，获得绿色荧光单体信号（在凋亡细胞中），并使用FL2通道检测橙色荧光聚集信号（在健康细胞中）。建议使用FCCP或CCCP处理的细胞进行补偿校正（见附录）。

 

数据分析

1.在活的非凋亡细胞中，JC-10作为细胞溶质染色绿色中的单体存在，并且还在线粒体染成红色的聚集体中积累。 在凋亡细胞和死细胞中，JC-10仅以单体形式存在，染色细胞溶质绿。
2.使用FL2通道可检测到健康细胞中含有红色JC-10聚集体的线粒体。 通过使用FL1通道（FITC）可检测凋亡细胞中的绿色JC-10单体。
3. FL1与FL2的强度比用于监测化合物处理诱导的线粒体膜电位变化。

图1. FCCP诱导的JurKat细胞线粒体膜电位变化的影响。 将JurKat细胞染色载有JC-10染料加载溶液以及DMSO（Top）或5μMFCCP（低）10分钟。 使用FL1和FL2通道，用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式细胞仪测量J-聚集体和单体形式JC-10的荧光强度。 将未补偿的数据（左栏）与补偿数据（右栏）进行比较。

 

参考文献

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