新型钙离子荧光探针Calbryte520L AM

细胞内钙流测定是一种广泛用于检测信号转导途径和高通量筛选 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和钙通道靶标的方法。继 1989 年推出 Fluo-3 后，随后开发了 Fluo-4、Fluo-8 和 Cal-520，具有增强的信号背景比，并很快成为共聚焦显微镜、流式细胞术和高通量细胞分析的首选 Ca2+ 指示剂。通量筛选应用。然而，Fluo-4 仍有一些注意事项。例如，与Fluo-3一样，Fluo-4的细胞内保留性较差，需要使用丙磺舒来防止细胞负载的Fluo-4漏出细胞外。在基于 Fluo-4 的钙测定中使用丙磺舒会损害测定结果，因为丙磺舒已被充分证明具有多种复杂的细胞效应。 Calbryte 520L, AM 是一种新型荧光和细胞渗透性钙指示剂。与其他染料 AM 细胞负载一样，Calbryte 520L AM 酯不发出荧光，一旦进入细胞内部，就会被细胞内酯酶水解并被激活。激活的指示剂是一种极性分子，不再能够通过细胞膜自由扩散，并且基本上被困在细胞内。 Calbryte 520L 对钙离子的亲和力较低，Kd ∼ 91 µM。 Calbryte 520L 在高浓度钙存在的情况下会产生明亮的荧光信号。与Fluo-4具有相同的激发和发射波长；因此，相同的 Fluo-4 测定设置可以轻松应用于基于 Calbryte 520L 的钙测定。

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实验方案

溶液配制

1.储备溶液配制

Calbryte 520L AM 储备溶液

在无水 DMSO 中制备 2 至 5 mM Calbryte 520L AM 储备溶液。

注意：当在 DMSO 中复溶时，Calbryte 520L AM 是透明、无色的溶液。

2.工作溶液配制

Calbryte 520L AM 工作溶液

实验当天，将 Calbryte -520L AM 溶解在 DMSO 中，或将等份染料储备溶液解冻至室温。

在您选择的缓冲液（例如 Hanks 和 Hepes 缓冲液）（货号20011）中用 0.04% Pluronic® F-127 制备 2 至 20 µM Calbryte 520L AM 工作溶液。对于大多数细胞系，建议终浓度为 4-5 μM 的 Calbryte 520L AM。细胞加载所需指示剂的准确浓度必须根据经验确定。

注意：非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 有时用于增加 Calbryte 520L AM 的水溶性。可以从百萤购买购买。

注意：如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（孔中的最终浓度为 0.5-1 mM），以减少脱酯后染料的外漏。各种 ReadiUse 丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从百萤购买。

操作步骤

以下是我们推荐的将Calbryte 520L AM加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）将细胞在生长培养基中培养过夜。

b）第二天，将 1X Calbryte 520L AM 工作溶液添加到细胞孔板中。

注意：如果您的化合物干扰血清，请在上样前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

c）将载有染料的孔板在细胞培养箱中于 37°C 下孵育 30 至 60 分钟。

注意：孵育染料超过 1 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

d）用 HHBS 或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，例如 1 mM 丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。

e）根据需要添加刺激剂，同时使用配备 FITC 滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（例如 FDSS、FLIPR 或 FlexStation）的荧光酶标仪在 Ex/Em = 490/525 nm 处测量荧光。