钙离子荧光探针Cal590钾盐

钙离子荧光探针Cal-590 钾盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，钙的测量对于许多生物学研究至关重要。荧光探针显示结合钙的光谱响应，使研究人员能够通过荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪研究细胞内游离钙浓度的变化。 Rhod-2最常用于红色荧光钙指示剂中。然而，Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中发生中度荧光，并且具有非常小的细胞钙响应。 Cal-590 已被开发用于改善Rhod-2细胞负载和钙响应，同时保持Rhod-2的光谱波长，使其与TRITC /Cy3®过滤器组兼容。在CHO和HEK细胞中，Cal-590 AM具有比Rhod-2 AM更敏感的细胞钙响应。 Cal-590的光谱与FITC，AlexaFluor®488和GFP的光谱完全分离，使其成为用GFP细胞系或FITC / AlexaFluor®488标记抗体复合细胞内检测的理想钙探针。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针Cal-590 钾盐。 

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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针

使用Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯类

 

1.使用Cal-520®，Cal-590 或Cal-630 AM酯类：

        AM酯是非极性酯，其可以容易地穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南，应根据具体实验修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b）在实验当天，将Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液中使用0.04％Pluronic®F-127制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 酯的水溶性。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，则可将丙磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（浓度为0.5-1 mM）以减少渗漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟，然后将板在室温下再孵育30分钟。

注意：孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f）用HHBS（如果适用）替换染料工作溶液，选择含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液，以去除多余的探针。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（对于Cal-520 AM），540 / 5000nm（对于Cal-590 AM）或600 / 640nm（对于Cal-630 AM ）进行实验。

 

2.测量细胞内钙响应：

图1. 没有丙磺舒的CHO-M1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。将100μl的4μMFluo -3AM，Fluo- 4AM 或Cal202®AM在HHBS中加入孔中，并将细胞在37℃下孵育2小时。用100μlHHBS替换染料加载培养基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

 

图2. 用Cal-520 或Fluo-4 AM 测量的CHO-K1细胞中ATP刺激的内源性P2Y受体的钙响应。在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K1细胞以每100μL /孔50,000个细胞接种过夜。100μL的5 μ 中号的Fluo-4 AM或校准- 520® AM与（A）或不具有（B）2.5mM丙磺舒加入到细胞中，并将细胞在37下温育^ø下进行2小时。 通过FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以达到终指示的浓度。

 

图3. CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。将CHO-K细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜，在96孔黑壁/透明底板中。将100μl含有1mM丙磺舒的HHBS中的4μMCal590 AM或Cal 630 AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育2小时。将染料上样培养基替换为100μlHHBS和1mM丙磺舒，然后在添加50μl300μMATP 之前和之后使用TRITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

 

参考文献

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