ATTO 647 NHS酯

产品货期

咨询

 

产品优势

1.易于结合：标记蛋白质和配体上的伯胺，胺修饰的寡核苷酸 

2.高量子产率和光稳定性：为敏感应用提供强烈、稳定的荧光

3.高亲水性:  减少聚集，提高信号清晰度，适用于高级成像和活细胞研究 

 

适用范围

标记蛋白质、胺修饰寡核苷酸和其他含胺分子

 

产品介绍

AAT Bioquest生产的ATTO 647 NHS酯是胺反应性染料，用于标记氨基，ATTO 647是罗丹明的荧光标记，与Cy5光谱特性相似。它具有强吸收，高荧光量子产率和光稳定性，在pH 4-10范围内荧光不受影响且光稳定性好，适用于单分子检测应用，高分辨率显微镜（如SIM，STED） ），流式细胞仪（FACS）和荧光原位杂交（FISH）

点击查看光谱

溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备液应在制备后分装，在 -20°C 下储存避免反复冻融

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将 100 µL 反应缓冲液（例如，pH 值约为 8.5 至 9.0 的 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白质浓度 > 2 mg/mL（如果可能））混合得到 1 mL 蛋白质标记储备液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，除去蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，获得好的标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，标记效率会显着降低。为获得合适标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

 

2.准备染料储备溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入到ATTO647 NHS 酯小瓶中制备10mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），立即使用。 染料储备溶液的长期储存会降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免反复冻融。

 

样本实验方案

（本方案适用ATTO647 NHS 酯标记山羊抗小鼠 IgG，每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。）

进行偶联反应：

1.使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL，蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟

 

纯化偶联

（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）

1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。

注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

表征所需的染料-蛋白质缀合物

取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS（例如 DOS > 6）的蛋白质也往往具有减弱的荧光。大多数抗体的最佳 DOS 建议在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，取代度应控制为每摩尔抗体有 6-8 摩尔 ATTO 647 NHS 酯。以下步骤用于确定 ATTO 647 NHS 酯标记蛋白的 DOS。

检测吸收率

要测量染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在 1-10 µM 范围内。

读取 280 nm 处的 OD（吸光度）和染料最大吸光度（对于 ATTO 647 NHS 酯，ƛmax = 646 nm ）

对于大多数分光光度计，样品（来自柱馏分）需要用去离子水稀释，以便 O.D.值范围为 0.1 至 0.9。外径（吸光度）280 nm 是蛋白质的最大吸收，而 646 nm 是 ATTO 647 NHS 酯的最大吸收。为了获得准确的 DOS，请确保缀合物不含非缀合染料。

计算DOS

您可以通过以下链接使用我们的工具计算 DOS：https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator