Annexin V, FITC标记

Annexin V, FITC标记是美国AAT Bioquest生产的膜联蛋白，膜联蛋白是在钙存在下与磷脂膜结合的蛋白质家族。膜联蛋白V是研究细胞凋亡的有用工具。它被用作探针以检测在细胞表面上表达磷脂酰丝氨酸的细胞，这是细胞凋亡中发现的特征以及其他形式的细胞死亡。有多种参数可用于监测细胞活力。膜联蛋白V-染料结合物广泛用于通过测量磷脂酰丝氨酸（PS）的易位来监测细胞凋亡。在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示，并且可以在观察到形态变化之前检测到。该荧光FITC-膜联蛋白V缀合物广泛用于通过流式细胞仪或荧光显微镜监测细胞凋亡。对于基于膜联蛋白V的细胞凋亡检测的微孔板检测，我们建议您使用我们的Cell Meter 试剂盒。百萤生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的Annexin V, FITC标记探针。

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操作步骤

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

1.1     制备膜联蛋白V缀合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl₂，pH 7.4。

1.2     用测试化合物处理细胞一段时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

1.3     离心细胞，得到1-5×10 ⁵个细胞/管。

1.4     将细胞重悬于200μLAnnexin V缀合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。

1.5     在细胞中加入2μL膜联蛋白V缀合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于死细胞。

1.6     在室温下进行30至60分钟，避光。

1.7     在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μLAnnexin V缀合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。

1.8     使用流式细胞仪或荧光显微镜检测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。

2.使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当滤波器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：对贴壁细胞的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经过常规测试，因为在细胞分离过程中可能会发生特定膜损伤。

3.使用荧光显微镜分析：

3.1    吸取步骤1.6中的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到载玻片上并盖上盖玻片。

注意：对于贴壁细胞，建议直接在盖玻片上培养细胞。 与膜联蛋白V结合物孵育后（步骤1.6），用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片上。 将盖玻片倒在载玻片上并使细胞可视化。 与膜联蛋白V缀合物一起孵育后，也可以将细胞固定在2％甲醛中，并在显微镜下观察。

3.2     在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞。

参考文献

Response of Mammalian cells to non-thermal intense narrowband pulsed electric fields
Authors: Sunao Katsuki, Yulan Li, Daiki Miyakawa, Ryo Yamada, Nobuaki Onishi, Soowon Lim
Journal: (2017): 1358--1361

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