Amplite 荧光法通用型基质金属蛋白酶MMP活性检测试剂盒 绿色荧光

Amplite 荧光法通用型基质金属蛋白酶MMP活性检测试剂盒 绿色荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测MMP的试剂盒，基质金属蛋白酶（MMP）构成锌依赖性内肽酶家族，其在细胞外基质内起作用。 这些酶负责结缔组织的分解，并且在骨重塑，月经周期和组织损伤的修复中是重要的。虽然很难评估MMP对某些病理过程的确切贡献，但MMP似乎在关节炎的发展以及癌症的侵袭和转移中起关键作用。

我们的Amplite 通用荧光MMP活性测定试剂盒使用Tide Fluor 2（TF2）/ Tide Quencher 2（TQ2）荧光共振能量转移（FRET）肽作为通用MMP活性指示剂。 它旨在检查MMP酶的一般活性并筛选MMP抑制剂。 在完整的FRET肽中，TF2的荧光被TQ2猝灭。 在通过MMP切割成两个单独的片段后，回收TF2的荧光。 TF2探针具有优异的荧光量子产率和更长的波长，比EDANS / Dabcyl FRET底物灵敏得多。 其信号可通过荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm处轻松读取。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法通用型基质金属蛋白酶MMP活性检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em:	525nm
Cutoff:	515nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

添加适当的对照或测试样品（50μL）

预孵育10-15分钟

添加MMP Green™底物溶液（50μL）

孵育0分钟（用于动力学读数）或30分钟至1小时（终点读数）

在Ex / Em = 490/525 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.根据需要制备含有生物样品的MMP。

 

2.pro-MMPs：

2.1制备2mM APMA工作溶液（2X）：用1：500稀释1M APMA（组分B）和测定缓冲液（组分C），得到2mM APMA工作溶液（2X）。

注意：APMA属于有机汞。 小心轻放！ 根据当地法规处理。

2.2用APMA包埋MMPs：用等体积的2mM APMA工作溶液（2X，来自步骤2.1）孵育含有MMP的样品或纯化的MMPs。 有关孵育时间，请参阅说明书中的附录I. 在实验之前立即MMP。

注意1：将含酶样品保存在冰上。 避免剧烈涡旋酶。长时间储存活化酶会使酶失活。

注意2：对于酶活化，优选在较高蛋白质浓度下活化。后，您可以进一步稀释酶。

 

3.准备工作解决方案：

3.1制备MMP Green™底物工作溶液：用1：100稀释MMP Green™底物（组分A）和测定缓冲液（组分C），如说明书中表1所示。

3.2制备MMP稀释：如果使用纯化的MMP，则在测定缓冲液（组分C）中将MMP稀释至合适的浓度。

注意：Pro-MMP需要在使用前（参见步骤2.2）。 避免剧烈涡旋酶。 

3.3制备抑制剂和化合物稀释：如果您正在筛选MMPs抑制剂，请根据需要稀释已知的MMPs抑制剂和测试化合物。

 

4.根据说明书中的表2和表3在96孔微孔板中建立酶促反应：

 

5.运行酶反应：

5.1如果您正在筛选MMPs抑制剂，则将培养板在酶反应（例如25°C或37°C）的所需温度下预孵育10-15分钟。

5.2将50μL（96孔）或20μL（384孔）MMP Green™底物溶液（来自步骤3.1）加入到测定板的样品和对照孔中。充分混合试剂。

5.3用Ex / Em = 490 / 525nm的荧光板读数器监测荧光强度。

动态读数：立即开始测量荧光强度，每5分钟连续记录数据30至60分钟。

终点读数：在室温下孵育反应30至60分钟，如果可能，避免光照。 充分混合试剂，然后测量荧光强度。

 

参考文献

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