Amplite 硫醇快速定量试剂盒 比色法

Amplite 硫醇快速定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于硫醇定量的试剂盒，具有马来酰亚胺基团的各种交联剂广泛用于将蛋白质与蛋白质或蛋白质交联至其他生物分子。马来酰亚胺交联技术的关键点是与单一蛋白质或抗体连接的马来酰亚胺的定量。马来酰亚胺可以在302nm下通过分光光度法直接测定。然而，620M-1cm-1的小消光系数使得该测定不敏感，并且该测定由于在相同波长下的蛋白质吸光度而进一步复杂化。 AAT Bioquest的Amplite 快速比色马来酰亚胺定量试剂盒使用我们专有的马来酰亚胺传感器Maleimide Blue ，在~780nm处具有大吸光度，可快速准确地量化马来酰亚胺。该测定的原理是马来酰亚胺蓝 与马来酰亚胺连接的样品反应，并且所得产物通过单个旋转柱以除去过量的传感器。测量纯化产物的吸收光谱，并且可以从780nm和280nm（对于蛋白质）或260nm（对于寡核苷酸和核酸）的吸光度比计算马来酰亚胺与蛋白质的比率。这种Amplite 快速马来酰亚胺定量试剂盒可在传统的比色皿，NanoDrop 分光光度计或方便的96孔吸光板读数器中进行，带有UV透明板。该试剂盒已广泛用于从蛋白质，寡核苷酸和核酸样品中快速定量马来酰亚胺基团。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 硫醇快速定量试剂盒。

样品实验方案

简要概述

1.准备GSH工作溶液（50μL）
2.添加GSH标准品或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10至60分钟
4.监测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光增加（截止= 515 nm）

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 GSH标准溶液（1 mM）：
将200μLddH2 O加入到GSH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol /μL）GSH标准溶液。

1.2 Thiolite Green原液（100X）：
将100μLDMSO（组分D）加入到Thiolite Green（组分A）的小瓶中以制备100X Thiolite Green原液。

2.标准溶液配制
将30μL的1mM（1nmol /μL）GSH标准溶液加入到970μL的测定缓冲液（组分B）中以产生30μM（30pmol /μL）GSH标准溶液。 取30μM（30 pmol /μL）GSH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到用分析缓冲液（组分B）连续稀释的GSH标准品（SD7-SD1）。 注意：稀释的GSH标准溶液不稳定。 在4小时内使用。

3.工作溶液配制

将50μL100XThiolite Green原液加入5 mL分析缓冲液（组分B）中，充分混合，制成GSH工作溶液。 注意：这种GSH工作溶液足以容纳一个96孔板。 在室温下不稳定，应在2小时内及时使用。 避免暴露在光线下。 注意：或者，可以通过按比例添加含有分析缓冲液（组分B）的100X Thiolite Green原液来制备GSH工作溶液。

操作步骤

表1.实心黑色96孔微孔板中GSH标准品和测试样品的布局。 SD = GSH标准品（SD1  -  SD7,0.014至10μM）; BL =空白对照; TS =测试样品

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备GSH标准品（SD），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。 注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.向GSH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLGSH工作溶液，使总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLGSH工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至60分钟，避光。

4.用荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）下监测荧光增加。

参考文献

Activation of transcription factors in human bronchial epithelial cells exposed to aqueous extracts of mainstream cigarette smoke in vitro
Authors: Takashi Sekine, Tadashi Hirata, Toshiki Mine, Yasuo Fukano
Journal: Toxicology mechanisms and methods (2016): 22--31