Amplite 荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测鞘磷脂的试剂盒，阳离子依赖性和佳作用pH鉴定了五种类型的鞘磷脂酶（SMase），它们是溶酶体酸性SMase，分泌锌依赖性酸性SMase，镁依赖性中性SMase，镁依赖性中性SMase和碱性SMase。 在这五种类型中，溶酶体酸性SMase和镁依赖性中性SMase被认为是细胞对应激反应中产生神经酰胺的主要候选物。

我们的Amplite 荧光鞘磷脂酶检测试剂盒为检测中性SMase活性或筛选其抑制剂提供了灵敏的方法。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光探针，间接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）产生的磷酸胆碱。它可用于测量血液，细胞提取物或其他溶液中的SMase活性。Amplite Red的荧光强度与磷酸胆碱的形成成正比，因此与SMase活性成正比。Amplite Red使测定可在荧光强度模式或吸收模式下读取。该试剂盒是一种优化的“混合和读取”试验，可用于Smase活动的实时监测。我们的试剂盒13622已经开发用于监测酸性SMase活性。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法鞘磷脂酶检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备鞘磷脂工作溶液（50μL）

添加SMase标准品和/或SMase测试样品（50μL）

在37°C孵育1-2小时加入鞘磷脂酶测定混合物（50μL）

在室温下孵育持续1-2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（在570 nm处截止）

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶（或瓶）。

 

操作方法

 

1.准备鞘磷脂工作液：

将50μL鞘磷脂（组分B）加入5mL SMase反应缓冲液（组分D）中，并充分混合。

注意：应及时使用鞘磷脂工作液。

 

2.制备鞘磷脂酶标准品和/或含鞘磷脂酶的样品：

2.1将20μL含0.1％BSA的PBS加入到鞘磷脂酶标准品（组分F）的小瓶中，制成10单位/ mL鞘磷脂酶标准储备液。

注意：应将未使用的鞘磷脂酶标准储备液等分并保存在-20℃。

2.2将1μL的10单位/ mL鞘磷脂酶标准储备液（来自步骤2.1）加入1000μL测定缓冲液（组分E）中以产生10mU / mL鞘磷脂酶标准品。

注意：稀释的鞘磷脂标准储备液不稳定，应在4小时内使用。

2.3取500μL10mU / mL鞘磷脂酶标准品进行1至2次连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 mU / mL连续稀释的鞘磷脂酶标准品。

2.4将连续稀释的鞘磷脂酶标准品和/或含鞘磷脂酶的测试样品加入固体黑色96孔微量培养板中，如说明书中的表1和2所示。

注意：根据需要处理您的细胞或组织样本。

2.5将50μL鞘磷脂工作溶液（来自步骤1）加入到鞘磷脂酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（来自步骤2.4）。

2.6将反应混合物在37℃下孵育1-2小时。

 

3.准备200X Amplite™Red原液：

将80μLDMSO（组分G）加入到Amplite™Red（组分C）的小瓶中以制备200X Amplite™Red储备溶液。

注意1：未使用的Amplite™Red原液应等分并保存在-20℃（避光）。

注意2：在硫醇（如DTT和2-巯基乙醇）存在下，Amplite™Red不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应低于10μM。 Amplite™Red在高pH（> 8.5）下也不稳定。反应应在pH 7-8下进行。建议将pH 7.4用于测定缓冲液。

 

4.准备鞘磷脂酶测定混合物：

4.1将5 mL测定缓冲液（组分E）加入酶混合物瓶（组分A）中，并充分混合。

4.2在开始测定之前，将25μL的200X Amplite™Red储备溶液（来自步骤3）加入到酶混合物溶液瓶（来自步骤4.1）中以制备鞘磷脂酶测定混合物。

注意：应立即使用鞘磷脂酶试验混合物并避光; 较长的储存可能会导致高分析背景。

 

5.运行鞘磷脂酶测定：

5.1将50μL鞘磷脂酶测定混合物（来自步骤4.2）加入鞘磷脂酶标准品，空白对照和测试样品（来自步骤2.4）的每个孔中，以使总鞘磷脂酶测定体积为150μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品，25μL鞘磷脂工作溶液和25μL鞘磷脂酶测定混合物。

5.2在室温下孵育反应混合物1-2小时（避光）。

5.3使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（在570nm处截止）观察荧光增加。

 

参考文献

Doxepin mitigates noise induced neuronal damage in primary auditory cortex of mice via suppression of acid sphingomyelinase/ceramide pathway
Authors: Yu-Ting Su, Xing-Xing Meng, Xi Zhang, Yi-Bin Guo, Hai-Jun Zhang, Yao-Ping Cheng, Xiao-Ping Xie, Yao-Ming Chang, Jun-Xiang Bao
Journal: The Anatomical Record (2017)

New Aspects of Silibinin Stereoisomers and their 3-O-galloyl Derivatives on Cytotoxicity and Ceramide Metabolism in Hep G2 hepatocarcinoma Cell Line
Authors: Mahdi Mashhadi Akbar Boojar, Shahram Ejtemaei Mehr, Mahsa Hassanipour, Masoud Mashhadi Akbar Boojar, Ahmad Reza Dehpour
Journal: Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2016): 421--433

Riccardin DN induces lysosomal membrane permeabilization by inhibiting acid sphingomyelinase and interfering with sphingomyelin metabolism in vivo
Authors: Lin Li, Huanmin Niu, Bin Sun, Yanan Xiao, Wei Li, Huiqing Yuan, Hongxiang Lou
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Mitochondrial respiration controls lysosomal function during inflammatory T cell responses
Authors: Francesc Baixauli, Rebeca Acín-Pérez, Carolina Villarroya-Beltrí, Carla Mazzeo, Norman Nunez-Andrade, Enrique Gabandé-Rodriguez, Maria Dolores Ledesma, Alberto Blázquez, Miguel Angel Martin, Juan Manuel Falcón-Pérez
Journal: Cell metabolism (2015): 485--498

The ATP-binding cassette transporter-2 (ABCA2) regulates esterification of plasma membrane cholesterol by modulation of sphingolipid metabolism
Authors: Warren Davis
Journal: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids (2014): 168--179

A high-throughput sphingomyelinase assay using natural substrate
Authors: Miao Xu, Ke Liu, Noel Southall, Juan J Marugan, Alan T Remaley, Wei Zheng
Journal: Analytical and bioanalytical chemistry (2012): 407--414

 

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