Amplite 荧光法神经鞘磷脂检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法神经鞘磷脂检测试剂盒  红色荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测鞘磷脂的试剂盒，鞘磷脂主要发现在细胞外表面，特别是神经组织中，其在信号传导中扮演着重要角色。有研究发现，鞘磷脂在尼曼匹克症和无脂蛋白血症中存在不正常的积累。Amplite鞘磷脂荧光法检测试剂盒采用了灵敏的方法检测中性鞘磷脂的活性和筛选其抑制剂。这个试剂盒利用独特的Amplite Red作为荧光探针直接定量被鞘磷脂酶水解作鞘磷脂所产生的磷酸胆碱的含量。它可以用来检测血液、细胞提取物或者其他溶液中鞘磷脂的含量。Amplite Red的荧光强度与磷酸胆碱产生成比例，从而实现鞘磷脂酶的定量。本试剂盒可用于96或384微孔板分析，并且无需任何额外步骤，就可以轻易地实现自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法神经鞘磷脂检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备SMase工作溶液（50 µL）
2.加入鞘磷脂标准品或测试样品（50 µL）
3.在37°C下孵育1-2小时
4.加入鞘磷脂测定混合物（50 µL）
5.在室温下孵育0.5-2小时
6.监视Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（在570 nm处截止）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 SMase储备溶液（100X）：
将50 µL含0.1％BSA的PBS加入鞘磷脂酶（小瓶B）中，制成SMase储备液（100X）。

1.2 Amplite Red储备液（200X）：
将80 µL DMSO（组分G）加入小瓶Amplite Red（组分C）中，制成200X Amplite Red储备液，避光。 注意：Amplite Red在存在硫醇（例如DTT和2-巯基乙醇）的情况下不稳定。 反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应低于10 µM。 Amplite Red在高pH（> 8.5）时也不稳定。 反应应在pH 7-8下进行。建议将pH 7.4用于测定缓冲液。

 

2.标准溶液

鞘磷脂标准品
向1000 µL SMase反应缓冲液（组分D）中加入2 µL 50 mM鞘磷脂（组分F），得到100 µM鞘磷脂标准溶液（SM7）。取100 µM鞘磷脂标准溶液进行1：3连续稀释，以得到连续稀释的鞘磷脂标准品（SM6-SM1）。

 

3.工作溶液

3.1 鞘磷脂酶（SMase）工作液：
将100X SMase储液的全部内容物（50 µL）加入5 mL SMase Reaction Buffer（组分D）中，并混合均匀，以制备SMase工作溶液。 注意：应立即使用SMase工作解决方案。

3.2 鞘磷脂工作液：
将全部含量（5 mL）的测定缓冲液（组分E）添加到酶混合瓶（组分A）中，并充分混合。 在开始测定之前，将25 µL 200X Amplite Red储备液加到Enzyme Mix溶液瓶中以制成鞘磷脂测定混合物。 注意：鞘磷脂测定混合物应立即使用，并避免光照。 较长的存储时间可能会导致较高的测定背景。

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样品操作及实验分析

表1.黑色素96孔微孔板中鞘磷脂标准品和测试样品的布局。 SM =鞘磷脂标准品（SM1-SM7，0.1至100 µM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
SM1	SM1	...	...
SM2	SM2	...	...
SM3	SM3
SM4	SM4
SM5	SM5
SM6	SM6
SM7	SM7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
SM1-SM7	50ul	连续稀释液（0.1至100 µM）
BL	50ul	SMase反应缓冲液
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局，准备鞘磷脂标准品（SM），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂代替50 µL。注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.将50 µL SMase工作溶液添加到鞘磷脂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使鞘磷脂的总测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，向每个孔中添加25 µL SMase工作溶液，总体积为50 µL /孔。

3.将反应混合物在37°C下孵育1-2小时。

4.将50 µL鞘磷脂测定混合物添加到鞘磷脂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使鞘磷脂测定总体积为150 µL /孔。对于384孔板，将25 µL鞘磷脂测定混合物加到每个孔中，总体积为75 µL /孔。

5.将反应混合物在室温下孵育1-2小时（避光）。

6.使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540/590 nm（在570 nm截止）处监测荧光的增加。

 

参考文献

Doxepin mitigates noise induced neuronal damage in primary auditory cortex of mice via suppression of acid sphingomyelinase/ceramide pathway
Authors: Yu-Ting Su, Xing-Xing Meng, Xi Zhang, Yi-Bin Guo, Hai-Jun Zhang, Yao-Ping Cheng, Xiao-Ping Xie, Yao-Ming Chang, Jun-Xiang Bao
Journal: The Anatomical Record (2017)

New Aspects of Silibinin Stereoisomers and their 3-O-galloyl Derivatives on Cytotoxicity and Ceramide Metabolism in Hep G2 hepatocarcinoma Cell Line
Authors: Mahdi Mashhadi Akbar Boojar, Shahram Ejtemaei Mehr, Mahsa Hassanipour, Masoud Mashhadi Akbar Boojar, Ahmad Reza Dehpour
Journal: Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2016): 421--433

Riccardin DN induces lysosomal membrane permeabilization by inhibiting acid sphingomyelinase and interfering with sphingomyelin metabolism in vivo
Authors: Lin Li, Huanmin Niu, Bin Sun, Yanan Xiao, Wei Li, Huiqing Yuan, Hongxiang Lou
Journal: Toxicology and Applied Pharmacology (2016): 175--184

Mitochondrial respiration controls lysosomal function during inflammatory T cell responses
Authors: Francesc Baixauli, Rebeca Acín-Pérez, Carolina Villarroya-Beltrí, Carla Mazzeo, Norman Nunez-Andrade, Enrique Gabandé-Rodriguez, Maria Dolores Ledesma, Alberto Blázquez, Miguel Angel Martin, Juan Manuel Falcón-Pérez
Journal: Cell metabolism (2015): 485--498

The ATP-binding cassette transporter-2 (ABCA2) regulates esterification of plasma membrane cholesterol by modulation of sphingolipid metabolism
Authors: Warren Davis
Journal: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids (2014): 168--179

A high-throughput sphingomyelinase assay using natural substrate
Authors: Miao Xu, Ke Liu, Noel Southall, Juan J Marugan, Alan T Remaley, Wei Zheng
Journal: Analytical and bioanalytical chemistry (2012): 407--414

 

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