Amplite 荧光法丙酮酸检测试剂盒

Amplite 荧光法丙酮酸检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测丙酮酸的试剂盒，丙酮酸是细胞内代谢途径中的重要化合物。它来源于称为糖酵解的葡萄糖代谢。一分子葡萄糖分解成两个丙酮酸分子，通过两种方式之一提供活细胞能量。当氧气存在时（有氧呼吸），丙酮酸被丙酮酸脱氢酶转化为乙酰-CoA，丙酮酸脱氢酶进入柠檬酸循环（也称为三羧酸循环）产生ATP。当氧气不足时，丙酮酸盐会厌氧分解，在动物体内产生乳酸盐，在植物和微生物体内产生乙醇。丙酮酸盐的异常水平或乳酸盐与丙酮酸盐的浓度比可能与肝脏疾病或代谢紊乱有关，并且是患者临床和其他实验室研究中的一种诊断测量。 AAT Bioquest的Amplite 比色丙酮酸测定试剂盒提供了一种灵敏的比色测定法，用于定量样品中的丙酮酸。它利用释放过氧化氢的酶偶联反应，可通过吸光度酶标仪在575 nm处通过丙酮酸盐传感器检测。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法丙酮酸检测试剂盒。 

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备测试样品（50 µL）以及连续稀释的丙酮酸标准液（50 µL）
2.加入等体积的丙酮酸工作溶液（50 µL）
3.在室温下孵育30分钟至1小时
4.监测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液（200X）：
将55 µL DMSO（组分E）添加到Quest Fluor 丙酮酸传感器（组分A）中，制成200X Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液。

1.2 丙酮酸标准溶液（1 mM）：
将10 µL 100 mM丙酮酸盐（组分D）添加到990 µL PBS（pH 7）中，得到1 mM丙酮酸盐溶液。

 

2.标准溶液

丙酮酸标准
将100 µL的1 mM丙酮酸标准溶液加入900 µL PBS中制成100 µM丙酮酸溶液（PS7）。 然后执行1：3连续稀释以获得连续稀释的丙酮酸标准品（PS6-PS1）。

 

3.工作溶液

3.1 将5 mL测定缓冲液（组分C）加入一瓶酶混合1瓶（组分B1）中； 混合均匀。

3.2 将100μLddH₂O加入一个酶混合物2小瓶（组分B2）中； 混合均匀。

3.3 将整个小瓶（100μL）的Enzyme Mix 2和25 uL的200X Quest Fluor 丙酮酸传感器储备溶液转移到Enzyme Mix 1瓶中。 混合均匀。 注意：丙酮酸工作溶液不稳定，应立即使用，避免光照。

 

样品操作及实验分析

表1.黑色96孔微孔板中丙酮酸标准品和测试样品的布局。 PS =丙酮酸标准溶液（PS1-PS7，0.1至100 µM）； BL =空白对照； TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
PS1	PS1	...	...
PS2	PS2	...	...
PS3	PS3
PS4	PS4
PS5	PS5
PS6	PS6
PS7	PS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
PS1-PS7	50ul	连续稀释（0.1至100 µM）
BL	50ul	PBS
TS	50ul	样品

1.根据表1和表2提供的布局，将丙酮酸标准液（PS），空白对照（BL）和测试样品（TS）制备成黑色的96孔微孔板。对于384孔板，请使用25 µL 每孔试剂，而不是50 µL。

2.在丙酮标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL丙酮酸工作溶液，使丙酮酸测定总体积为100 µL /孔。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。 在6.5至7.0的pH值下运行丙酮酸盐测定。

3.将反应混合物在室温下孵育30分钟至1小时。

4.使用荧光板读数器在Ex / Em = 540/590 nm（截止：570 nm）下监测荧光的增加。

 

参考文献

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