Amplite NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

Amplite NADH检测试剂盒（荧光法）是美国AAT Bioquest 研发的检测NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。

传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 传统NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短UV波长使得这些方法具有低灵敏度和高干扰。 由于NAD和NADH的吸收较弱，紫外吸收方法需要较大的样品量，如果样品的可用性有限，则使相同的NAD和NADH测量不实用。

这种Amplite 荧光NADH检测试剂盒为检测NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶在酶循环反应中特异性识别NADH。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显著降低了生物样品的干扰。 Amplite 荧光NADH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（1μM）内检测少至100皮摩尔的NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite NADH检测试剂盒。 

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟 -  2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度

 

1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NADH反应混合物：
将10mL Amplite NADH测定缓冲液（组分B）加入NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：这种NADH反应混合物足以用于两个96孔或四个384孔板。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至100μM）：
3.1将50μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中以产生100μM（100pmol / L）NADH标准溶液。
注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的100μMNADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到30,1,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADH标准品系列稀释液。

3.3如表1和表2所述，将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中
注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADH测定：
4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADH测定体积为100μL/孔
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm处佳）。
注1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
注2：对于基于细胞的NADH测量，建议使用ReadiUse 哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
        注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech）在96孔黑色板中用Amplite NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时，可以检测到低至1μM（100pmol /孔）的NADH，而NAD没有响应。

 

参考文献

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