Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 红色荧光 是美国AAT Bioquest生产的检测谷胱甘肽过氧化物酶的试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是具有过氧化物酶活性的酶家族，以保护生物体免受氧化损伤。GPx在将有机氢过氧化物（例如脂质氢过氧化物）还原成其相应的醇或将游离过氧化氢还原成水。因此，它可以防止细胞膜和细胞中其他氧化剂敏感位点的氧化损伤。现在科研已经注意到，改变GPx水平与由许多评论和复杂疾病引起的损伤相关。在生物样品中测量GPx水平，作为潜在癌症，糖尿病，神经退行性疾病和心血管疾病的潜在指标。AAT Bioquest的荧光谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒提供灵敏的荧光测定法，用于测量生物样品中的GPx水平。该测定基于GPx催化的谷胱甘肽（GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。生成的GSSG通过谷胱甘肽还原酶（GR）和NADPH再循环至还原态GSH：
R-O-O-H + 2GSH GPx R-O-H + GSSG + H2O
GSSG + NADPH + H+ GR 2GSH + NADP+
产品NADP +可以使用我们新开发的专有NADP传感器Quest Fluor™NADP Probe进行专门监控。 NADP传感器仅与NADP反应产生荧光产物。 荧光信号可以用荧光酶标仪在Ex / Em = 420 / 480nm处测量，其与GPx活性成正比。与测量NADPH在340 nm处吸光度降低的其他商业试剂盒相比，我们的Quest Fluor™NADP探针可用于直接量化NADP水平。通过这种荧光测定GPx测定，我们能够在155μL反应体积中检测低至1.2 mU / mL的GPx。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite 荧光法谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| Ex: | 420nm |
| Em: | 480nm |
| Cutoff: | 430nm |
| 推荐孔板: | 纯黑色孔板 |
96孔板的测定方案
概述
准备GPx分析混合物（50μL）
添加GPx标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育30分钟
加入20μLQuestFluor™NADP探针
添加20μLNAP检测溶液
在室温下孵育10-20分钟
添加15μL增强剂
溶液在室温孵育30-60分钟，在Ex / Em = 420 / 480nm处记录荧光
注意1.为了获得佳效果，强烈建议使用黑色版。
注意2.在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的一个小瓶。
操作方法
1.制备谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）标准储备液：
将50μLddH2O或1×PBS缓冲液加入到GPx标准品（组分A）的小瓶中，制成10U / mL标准储备溶液。
注意：未使用的GPx标准储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20ºC。
2.准备GPx标准的系列稀释液：
2.1将4μLGPx标准储备溶液（10U / mL，来自步骤1）加入996L 1×PBS缓冲液中，以产生浓度为40mU / mL的标准溶液。
注意：稀释的GPx标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
2.2取200μL40mU / mL GPx标准溶液进行1：2连续稀释，得到大约20,10,5,2.5,1.25,0.625和0 mU / mL的GPx标准品系列稀释液。
2.3如表1和2中所述，将GPx标准品和含有GPx的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
表1实心黑色96孔微孔板中GPx标准品和测试样品的布局
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BL |
BL |
TS |
TS |
…. |
…. |
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GP 1 |
GP 1 |
…. |
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…. |
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GP 2 |
GP 2 |
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GP 3 |
GP 3 |
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GP 4 |
GP 4 |
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GP 5 |
GP 5 |
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GP 6 |
GP 6 |
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GP 7 |
GP 7 |
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注意：GP = GPx标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2每个孔的试剂组成
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GPx Standard |
Blank Control |
Test Sample |
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Serial Dilutions*: 50 μL |
1×PBS Buffer : 50 μL |
50 μL |
*注意：将连续稀释的GPx标准品从大约0.6 mU / mL加到40 mU / mL，一式两份加入GP1到GP7的孔中。
3.准备GSH原液（100X）：
将100μlddH2 O加入到GSH小瓶（组分D）中以制备100X GSH储备溶液。
4.准备GPx底物储备液（100X）：
将100μlddH2O加入到基质小瓶（组分E）中以制备100X底物储备溶液。
5.准备GPx分析混合物：
5.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶混合物（组分C）中。
5.2将50μLGSH储备溶液（来自步骤3的组分D），50μL底物储备溶液（组分E，来自步骤4）加入到组分B + C的瓶子中（来自步骤5.1），并充分混合以进行GPx测定 混合物（组分B + C + D + E）。
注1：该GPx测定混合物足以用于一个96孔板。 它不稳定，请及时使用。
注2：不建议储存未使用的GPx分析混合物。 可以将未使用的组分B + C混合物（来自步骤5.1）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC，尽管灵敏度可能会降低。
注3; 将未使用的100X GSH储备溶液（来自步骤3）和100X GPx底物储备溶液（来自步骤4）分成单次使用的等分试样并储存在-20ºC。
6.运行GPx分析：
6.1将50μLGPx测定混合物（来自步骤5.2）加入到GPx标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤2.3），使总体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLGPx测定混合物。
6.2在室温下孵育反应30分钟，避光。
7.运行NADP测定：
7.1将20μLQuestFluor™NADP探针（组分F）加入到GPx标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中，充分混合。
7.2在每个孔中加入20μLNAP检测溶液（组分G），充分混匀。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针（组分F）和10μLNAP检测溶液（组分G）。
7.3在室温下孵育反应10-20分钟，避光。
7.4向每个孔中加入15μL增强剂（组分H），使总测定体积为155μL/孔，并在室温下孵育30-60分钟，避光。
注意：对于384孔板，添加7.5μL增强剂。
7.5使用荧光读板仪在Ex / Em = 420/480 nm处监测荧光增加。
参考文献
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Daily rhythms of catalase and glutathione peroxidase expression and activity are endogenously driven in the hippocampus and are modified by a vitamin A-free diet
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