Amplite 荧光法谷氨酸氧化酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法谷氨酸氧化酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的谷氨酸检测的试剂盒，谷氨酸氧化酶属于氧化还原酶的一类，特别能对带有CH-NH2基团供氧受体起反应。它是一种能特异催化水中或者氧气中的L-谷氨酸的酶，可以通过氧化脱氨形成酮戊二酸，氨和过氧化氢。Amplite谷氨酸氧化酶荧光检测试剂盒提供了一种快速超敏感的方法，来检测溶解状态下或者细胞裂解液中的谷氨酸氧化酶。在分析中，L-谷氨酸可以通过谷氨酸氧化酶被氧化成酮戊二酸、氨或者过氧化氢。L-丙氨酸和L-谷氨酸-丙酮酸也参与了这个转氨酶反应，导致多次循环反应，因此显著的增加双氧水的产出。该试剂盒使用我们的Amplite Red底物使其成为双记录模式。红色的荧光信号很容易的通过荧光酶标仪（540／590nm）检测，或者使用酶标仪（576nm）检测。Amplite荧光法谷氨酸氧化酶检测试剂盒在100 ul检测体积中能检测到40U/ml的谷氨酸氧化酶。本试剂盒可以用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步骤，就可以轻易地实现自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法谷氨酸氧化酶检测试剂盒。 

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适用仪器

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荧光收酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.谷氨酸氧化酶标准品或测试样品（50μL）
2.添加谷氨酸氧化酶工作液（50μL）
3.在室温下孵育30-60分钟
4.在Ex / Em = 540 / 590nm处读取荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分F）加入到Amplite Red（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10μM。 Amplite Red在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH7-8下进行。推荐使用所提供的测定缓冲液，pH7.4。

1.2 HRP库存解决方案（400X）：
将200μL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

1.3 谷氨酸储备溶液（400X）：
将1.0mL ddH 2 O加入到谷氨酸小瓶（组分D）中以制备400X谷氨酸储备溶液。

1.4 谷氨酸氧化酶（GO）标准溶液（150 mU / mL）：
将100μL测定缓冲液（组分B）加入到谷氨酸氧化酶标准品（冻干，组分E）的小瓶中以制备150mU / mL谷氨酸氧化酶（GO）标准溶液。

 

2.标准溶液

谷氨酸氧化酶标准
将30μL150mU/ mL GO标准溶液加入420μL测定缓冲液（组分B）中，得到10mU / mL GO标准溶液（GO7）。 取10 mU / mL GO标准溶液进行1：3连续稀释，得到剩余的连续稀释的GO标准品（GO6-GO1）。

 

3.工作溶液

将20μLDelterite Red储备液（250X），12.5μLHRP储备溶液（400X）和12.5μL谷氨酸储备溶液（400X）加入5 mL分析缓冲液（组分B）中，使总体积为5.07 mL谷氨酸氧化酶工作溶液（GO工作溶液），避光。

 

样品分析

表1.固体黑色96孔微孔板中GO标准品和测试样品的布局。 GO =谷氨酸氧化酶标准品（GO1-GO7,0.01至10mU / mL），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
GO1	GO1	...	...
GO2	GO2	...	...
GO3	GO3
GO4	GO4
GO5	GO5
GO6	GO6
GO7	GO7

表2.每个孔的试剂组成。 较高浓度的GO可能由于Amplite Red（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低

孔	容积	试剂
GO1-GO7	50ul	连续稀释（0.01至10 mU / mL）
BL	50ul	分析缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局制备GO标准品（GO），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向GO标准品，空白对照品和测试样品的每个孔中加入50μLGO工作溶液，使总GO测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLGO工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应30至60分钟，避光。

4.用荧光板读数器在激发= 530-570nm，发射= 590-600nm（佳Ex / Em = 540 / 590nm），截止= 570nm监测荧光强度。 注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

 

参考文献

Extracellular polymeric substrates of Chlorella vulgaris F1068 weaken stress of cetyltrimethyl ammonium chloride on ammonium uptake
Authors: Feng Li, Yangduo Kuang, Na Liu, Fei Ge
Journal: Science of The Total Environment (2019)

 

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