Amplite 荧光法葡萄糖定量试剂盒

Amplite 荧光法葡萄糖定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于葡萄糖定量的试剂盒，葡萄糖是一种单糖，是生物学中重要的碳水化合物。它是细胞生长的能量和代谢中间体的来源。葡萄糖是光合作用的主要产物之一，并在原核生物和真核生物中开始细胞呼吸。葡萄糖水平是许多代谢紊乱的关键诊断参数。该葡萄糖测定试剂盒提供了用于测量各种生物样品（例如血清，血浆，体液，食物，生长培养基等）中的葡萄糖的快速且灵敏的方法。该试剂盒使用我们的Amplite Red底物，使该试剂盒可以在双重荧光测定或比色读数中进行记录。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。该测定是稳健的，并且可以容易地适用于需要测量葡萄糖的各种应用中的高通量测定。例如，该测定可能适合于监测发酵过程中的葡萄糖水平和蛋白质表达过程中的葡萄糖摄取。它也可用于监测葡萄糖转运蛋白。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法葡萄糖定量试剂盒。 

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样品实验方案

简要概述

准备并添加葡萄糖标准品和/或测试样品（50μL）
准备并添加葡萄糖分析工作溶液（50μL）
在37°C孵育10-30分钟
在Ex / Em = 540 / 590nm处检测荧光强度

 

溶液配制

1.储备溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1Amplite 红色储备液（250X）：
将100μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。注意：避免反复冻融循环。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的分析缓冲液（pH 7.4）。

1.2辣根过氧化物酶（HRP）储备液（10 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。注意：未使用的HRP溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20℃。

1.3葡萄糖氧化酶溶液（100 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖氧化酶（组分D）的小瓶中。注意：未使用的葡萄糖氧化酶溶液应分为一次性等分试样并储存在-20℃。

1.4葡萄糖原液（800mM）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖小瓶（组分F）中。注意：未使用的葡萄糖溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.标准溶液配制

2.1葡萄糖标准溶液配制
通过将适量的800mM葡萄糖储备溶液稀释到测定缓冲液（组分B）中来制备葡萄糖标准品，以产生30μM的葡萄糖浓度。 然后在测定缓冲液（组分B）中进行1：3连续稀释，得到约10,3,1,0.3,0.1和0.03μM连续稀释的葡萄糖标准品。 包括非葡萄糖缓冲液对照作为空白对照。

 

3.工作溶液配制

表1.一个透明底96孔微孔板的分析工作溶液（2X）

组分	容积
Amplite 红色储备液（250x）	20ul
HRP储备液（10 U / mL）	100ul
葡萄糖氧化酶溶液（100 U / mL）	100ul
分析缓冲液	4.78ml
总容积	5ml

 

操作步骤

表2.固体黑色96孔微孔板中葡萄糖标准品和测试样品的布局。

GS =葡萄糖标准品（GS1-GS7）; BL =空白对照; TS =测试样品。

 

BL	BL	TS	TS
GS1	GS1	...	...
GS2	GS2	...	...
GS3	GS3
GS4	GS4
GS5	GS5
GS6	GS6
GS7	GS7

 

表3.每个孔的试剂组成

葡萄糖标准溶液	空白对照	测试样品
连续稀释：50μL	测定缓冲液（化合物B）：50μL	50ul

注意：由于Amplite 红色底物（对非荧光产物）的过氧化，高浓度的葡萄糖（例如测试样品或标准品中的100μM）可能导致荧光信号减少。

 

葡萄糖测定

1.如表2和3中所述，将葡萄糖标准品和含葡萄糖的测试样品加入96孔黑色微孔板中。

2.将50μL葡萄糖测定工作溶液添加到葡萄糖标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（表2），以使总葡萄糖测定体积为100μL/孔。 注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.将反应在37℃孵育10至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm）监测荧光强度。

 

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算葡萄糖样品。 点击使用在线线性回归计算器。

图1.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在96孔黑色平板上用Amplite 荧光葡萄糖定量试剂盒测量葡萄糖剂量反应。

 

参考文献

Glucose metabolism ontogenesis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in the light of the recently sequenced genome: new tools for intermediary metabolism programming
Authors: Lucie Marandel, Vincent Véron, Anne Surget, Elisabeth Plagnes-Juan, Stéphane Panserat
Journal: Journal of Experimental Biology (2016): 734--743

High glucose potentiates L-FABP mediated fibrate induction of PPARα in mouse hepatocytes
Authors: Anca D Petrescu, Avery L McIntosh, Stephen M Storey, Huan Huang, Gregory G Martin, Danilo Landrock, Ann B Kier, Friedhelm Schroeder
Journal: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids (2013): 1412--1425

 

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