Amplite 荧光法L-抗坏血酸检测试剂盒

Amplite 荧光法L-抗坏血酸检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测抗坏血酸的试剂盒，L-抗坏血酸（也称为维生素C）是细胞分裂，生长和防御中植物和动物的关键代谢物。抗坏血酸由大多数哺乳动物物种的肝脏中的葡萄糖产生。对于人类而言，抗坏血酸必须从食物中获得才能存活，而缺乏足够的维生素C会导致坏血病，终可能导致死亡。抗氧化剂抗氧化剂可以降低患癌症和心血管疾病等慢性疾病的风险。在食品工业中，抗坏血酸及其钠，钾和钙盐通常用作抗氧化食品添加剂。 AAT Bioquest的Amplite 荧光抗坏血酸检测试剂盒提供灵敏的荧光检测，用于定量生物样品中的总抗坏血酸和脱氢抗坏血酸（DHA）与抗坏血酸的比例。它利用将抗坏血酸氧化成DHA的酶反应，可以通过荧光酶标仪用Ascorbrite Blue检测。该测定可以检测样品中1uM的总抗坏血酸。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法L-抗坏血酸检测试剂盒。 

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	340nm
Em:	430nm
Cutoff:	420nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.用稀释的抗坏血酸标准品（50μL）制备测试样品
2.加入等体积的工作溶液（50μL）
3.在室温下孵育30分钟至1小时
4.监测Ex / Em = 340 / 430nm处的荧光强度

 

溶液配制

1.储存溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1Ascorbrite Blue原液（200X）：
将50μLDMSO（组分E）加入Ascorbrite Blue（组分A）中以制备200X Ascorbrite Blue原液。

1.2抗坏血酸标准溶液（100 mM）：
将200μLddH₂O加入抗坏血酸标准小瓶（组分D）中以制备100mM抗坏血酸标准溶液。

 

2.标准溶液配制

2.1抗坏血酸标准溶液
将10μL100mM抗坏血酸加入990μL测定缓冲液中，得到1000μM抗坏血酸溶液（AA7）。 然后取1000μM抗坏血酸标准溶液，进行1：3连续稀释，得到连续稀释的抗坏血酸标准品（AA1 - AA6）。 注意：抗坏血酸水溶液不稳定，会氧化成DHA。

 

3.工作溶液配制

3.1总AA测定
将5mL测定缓冲液（组分C）加入一瓶酶混合物（组分B）中。 然后将25uL Ascorbrite Blue原液（200X）加入同一瓶中。 好好混合。

3.2DHA测定
在合适的容器中，加入5mL含有25uL AscorbriteTM Blue原液（200X）的测定缓冲液（组分C）。 好好混合。 注意：或者，可以通过在一个酶混合瓶（组分B）中加入100μLddH2O制备酶原液，制备50X酶原液，并按比例用于总AA测定（例如，1mL总AA测定工作溶液） ，将20μL50X酶原液和5μL200XAscorbrite Blue原液添加到1 mL分析缓冲液中。 注意：溶液及时使用，避免直接暴露在光线下。

 

操作步骤

表1.固体黑色96孔微孔板中抗坏血酸标准品和测试样品的布局。

AA =抗坏血酸标准品（AA1-AA7,1至1000μM）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
AA1	AA1	...	...
AA2	AA2	...	...
AA3	AA3
AA4	AA4
AA5	AA5
AA6	AA6
AA7	AA7

 

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
AA1-AA7	50ul	连续稀释（1至1000μM）
BL	50ul	分析缓冲液（组分C）
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2的布局制备抗坏血酸标准品（AA），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.在抗坏血酸标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μL工作溶液，使总抗坏血酸测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μL工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应30分钟至1小时。

4.用Ex / Em = 340 / 430nm的荧光板读数器监测荧光增加（截止：420nm）。

 

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算抗坏血酸样品。 点击使用在线线性回归计算器。

图1.使用Gemini酶标仪（Molecular Devices），在固体黑色96孔板上用Amplite 荧光抗坏血酸测定试剂盒测量抗坏血酸剂量反应。

 

参考文献

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Amplite 荧光法谷氨酸检测试剂盒 红色荧光	Cat#10054