Amplite 荧光法α-酮戊二酸定量试剂盒

Amplite 荧光法α-酮戊二酸定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的荧光染料。α-酮戊二酸（α-酮戊二酸）是克雷布斯循环中的关键分子，其决定了生物体的柠檬酸循环的总体速率。作为谷氨酸和谷氨酰胺的前体，α-酮戊二酸也是胃肠道细胞的代谢燃料。它可以降低蛋白质分解代谢并增加蛋白质合成，从而增强骨骼肌中的骨组织形成，并可用于临床应用。 α-酮戊二酸用于肾脏疾病;肠道和胃部疾病，包括感染;肝脏问题;白内障;和反复发酵的酵母菌感染。它还用于接受血液透析的肾病患者处理蛋白质的方式。 Amplite 荧光 α-酮戊二酸定量试剂盒提供灵敏的荧光测定，用于定量生物样品中的 α-酮戊二酸。它利用酶偶联反应释放过氧化氢，可使用 Amlite Red 在 Ex/Em ~540/590 nm 处检测（红色荧光）。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法α-酮戊二酸定量试剂盒。 

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em：	590nm
cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备测试样品和连续稀释的α-酮戊二酸标准品（50μL）
2.加入等体积的α-酮戊二酸工作液（50μL）
3.在37°C孵育60-90分钟
4.监测570nm处的吸光度强度

 

溶液制备

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1 Amplite 红色储备液（200X）：
将50μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red（组分A）的小瓶中以制备200X储备溶液。

 

2.标准溶液

2.1α-酮戊二酸标准
将10μL10mMα-酮戊二酸标准品（组分D）加入990μLPBS中，得到100μMα-酮戊二酸标准溶液（AKG7）。 然后进行1：2连续稀释以获得连续稀释的α-酮戊二酸标准品（AKG6-AKG1）。

 

3.工作溶液

3.1将5 mL测定缓冲液（组分C）加入一个酶混合物1瓶（组分B1）中并充分混合。

3.2将100μLDdH2O加入一个酶混合物2小瓶（组分B2）中并充分混合。

3.3将整个小瓶（100μL）的酶混合物2和25μL的200X Amplite Red储备溶液转移到小瓶混合物1的小瓶中并充分混合以制备α-酮戊二酸的工作溶液。 注意：5mLα-酮戊二酸工作溶液足以容纳一个96孔板。 它不稳定，请及时使用。

 

样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中α-酮戊二酸标准品和测试样品的布局。 AKG =α-酮戊二酸标准品（AKG1-AKG7,0.1至30μM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
AKG1	AKG1	...	...
AKG2	AKG2	...	...
AKG3	AKG3
AKG4	AKG4
AKG5	AKG5
AKG6	AKG6
AKG7	AKG7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
AKG1-AKG7	50ul	连续稀释液（0.1至30μM）
BL	50ul	分析缓冲液（组分C）
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2中提供的布局制备α-酮戊二酸标准品（AKG），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

2.向α-Ketoglutarate标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLα-酮戊二酸测定工作溶液，使总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLα-酮戊二酸工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.将反应在37℃孵育30-60分钟。

4.用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

 

参考文献

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