Amplite 荧光法酸性鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光

Amplite 荧光法酸性鞘磷脂酶检测试剂盒 红色荧光是美国AAT Bioquest生产的用于检测鞘磷脂的试剂盒，鞘磷脂酶（SMase）是一种酶，负责将鞘磷脂（SM）切割成磷酸胆碱和神经酰胺。SMase的在细胞反应中起重要作用，例如细胞生长调节，细胞分化，细胞周期停滞和程序性细胞死亡。已经基于它们的阳离子依赖性和佳作用pH鉴定了五种类型的鞘磷脂酶（SMase）。 它们是溶酶体酸性SMase，分泌锌依赖性酸性SMase，镁依赖性中性SMase，镁非依赖性中性SMase和碱性SMase。在五种类型的鞘磷脂酶中，溶酶体酸性SMase和镁依赖性中性SMase被认为是细胞应激反应中产生神经酰胺的主要因素。

我们的Amplite 荧光酸性鞘磷脂酶检测试剂盒是检测酸性SMase活性或筛选其抑制剂的灵敏方法之一。该试剂盒使用Amplite™Red作为荧光探针，间接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）产生的磷酸胆碱。Amplite Red的荧光强度与磷酸胆碱的形成成正比，因此与SMase活性成正比。 它可用于测量血液，细胞提取物或其他溶液中的SMase活性。该试剂盒是一种优化的“混合和读数”测定，与HTS液体处理仪器兼容。

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

制备酸性 SMase 标准品或 SMase 测试样品 (50 µL)

添加鞘磷脂工作溶液 (50 µL)

在37°C 孵育 2 - 3 小时

在室温下孵育持续1-2小时

添加鞘磷脂酶工作溶液 (50 µL)

室温孵育 1 - 2 小时

检测 Ex/Em = 540/590 nm 处的荧光增加（Cut= 570 nm）

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分的小瓶。

 

溶液配制

储备溶液配制

Amlite™ 红色储备溶液 (200X)：

将 80 µL DMSO（组分 F）添加到 Amplite Red（组分 C）小瓶中，制成 200X Amplite Red 储备溶液。

注意：Amplite™ Red 在硫醇（例如 DTT 和 2-巯基乙醇）存在下不稳定。反应中 DTT 或 2-巯基乙醇的最终浓度应低于 10 µM。 Amlite™ Red 在高 pH 值 (>8.5) 下也不稳定。反应应在 pH 7 – 8 下进行。建议使用 pH 7.4 的测定缓冲液。

 

标准溶液配制

为方便起见，请使用系列稀释计算器：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/13622

酸性鞘磷脂酶标准品：

用 20 mM 乙酸钠缓冲液（pH = 5.0，试剂盒中未提供）稀释酸性鞘磷脂酶储备液。我们建议的浓度范围为 10 U/mL 至 0.5 U/mL。注意：酸性鞘磷脂酶标准品（来自人胎盘）可从 Sigma-Aldrich (S-5383) 购买。或使用磷酸胆碱作为标准品，购买链接：Phosphocholine chloride Sigma Grade 72556-74-2 (sigmaaldrich.com)。稀释后的酸性鞘磷脂酶标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

 

工作溶液配制

1.鞘磷脂工作液

将 50 µL 鞘磷脂（组分 B）添加到 5 mL SMase 反应缓冲液（组分 D）中并充分混合。

注意：鞘磷脂工作液应及时使用。

2. 鞘磷脂酶工作液

将 5 mL 测定缓冲液（组分 E）添加到酶混合物（组分 A）瓶中并充分混合。在开始测定之前，将 25 µL 200X Amplite™ Red 储备溶液添加到酶混合溶液瓶中，制成鞘磷脂酶工作溶液。

注意：鞘磷脂酶工作液应及时使用并避光；较长的储存时间可能会导致较高的检测背景。

 

样品实验方案

表1. 酸性鞘磷脂酶标准品和测试样品在黑色 96 孔孔板中的布局。 SMase = 酸性鞘磷脂酶标准品（SMase1-SMase7，0.5 至 10 U/mL）； BL = 空白对照； TS = 测试样品。

BL	BL	TS	TS
SMase1	SMase1	...	...
SMase2	SMase2	...	...
SMase3	SMase3
SMase4	SMase4
SMase5	SMase5
SMase6	SMase6
SMase7	SMase7

表2. 每孔的试剂成分

孔	体积	试剂
SMase1 - SMase7	50 µL	连续稀释 (0.5 to 10 U/mL)
BL	50 µL	20 mM 乙酸钠缓冲液（pH = 5）
TS	50 µL	测试样品

1. 将酸性鞘磷脂酶标准品和含有鞘磷脂酶的测试样品添加到黑色 96 孔板中，如表 1 和 2 所示。对于 384 孔板，每孔使用 25 µL 试剂。

注意：根据需要处理您的细胞或组织样本。

2. 将50 µL 鞘磷脂工作溶液添加到鞘磷脂酶标准品、空白对照和测试样品的每个孔中。添加稀释的酸性鞘磷脂酶标准品，一式两份。对于 384 孔板，请在每个孔中添加 25 µL 鞘磷脂工作溶液，总体积为 50 µL/孔。

3. 将反应混合物在 37°C 下孵育 2 - 3 小时。

4. 将 50 µL 鞘磷脂酶工作溶液添加到酸性鞘磷脂酶标准品、空白对照和测试样品的每个孔中，使总鞘磷脂酶测定体积为 150 µL/孔。对于 384 孔板，请在每个孔中添加 25 µL 鞘磷脂酶测定工作溶液，使鞘磷脂测定总体积为 75 µL/孔。

5. 将酶反应混合物在室温下孵育 1 - 2 小时（避光）。

6. 使用荧光酶标仪在 Ex/Em = 540/590 nm（Cutoff=570 nm ）处检测荧光。

 

图示

图示.  使用 Amplite® 荧光酸性鞘磷脂酶测定试剂盒 (13622) 在 96 孔黑色板上测量鞘磷脂酶（来自人胎盘）剂量反应。将 20 µL SMase 标准品或对照品与 20 µL 鞘磷脂工作溶液在 37 °C 下孵育 3 小时，然后将 20 µL 鞘磷脂酶测定混合物添加到每个孔中。图中所示的信号是室温孵育 2 小时后 Ex/Em = 540/590 nm（Cutoff=570 nm）处的读数。

 

参考文献

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A high-throughput sphingomyelinase assay using natural substrate
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