Amplite 比色法生物素定量试剂盒

Amplite 比色法生物素定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的Amplite系列试剂盒，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白 - 生物素相互作用是蛋白质与其配体之间强的已知非共价生物相互作用（Kd = 10-15M-1）。一种抗生物素蛋白结合四种生物素。生物素与抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白之间的键形成非常迅速，一旦形成，不受pH，有机溶剂和其他变性剂的影响。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白都具有基本上不可逆的生物素结合特性，因为结合的生物素只能通过使蛋白质的亚基变性来释放。生物素及其衍生物与各种抗生物素蛋白的紧密和特异性结合已被广泛研究用于许多生物学应用。 Amplite™比色生物素定量试剂盒提供了一种方便的方法，用于估算生物素 - 蛋白质结合物中生物素与蛋白质的摩尔比或用于定量溶液中生物素浓度。该测定使用HABA（4'-羟基偶氮苯-2-羧酸），这种试剂在与抗生物素蛋白结合时显示出显着的光谱变化。生物素容易从HABA /抗生物素蛋白复合物中置换HABA，导致500nm处的吸收减少。该试剂盒适用于测定2至16μM范围内的生物素浓度。可以以比色皿或微孔板形式进行测定。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 比色法生物素定量试剂盒。 

样品实验方案

简要概述

1.准备HABA /抗生物素蛋白测定溶液（180μL）
2.添加测试样品（20μL）
3.在室温下孵育5分钟
4.检测500nm处的吸光度

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
Avidin原液（100X）：
向Avidin（组分A）中加入400μLDdH2O，并充分混合。 注意：未使用的100X Avidin原液应分成一次性使用的等分试样并储存在-20℃。

2.工作溶液配制

HABA /抗生物素蛋白测定溶液：
将200μL抗生物素蛋白原液（100X）加入20 mL HABA分析缓冲液（组分B）中，并充分混合。 注意：HABA /抗生物素蛋白测定混合物的未使用部分可能在4°C储存至一周。

操作步骤

使用96孔微孔板定量生物素

表1.含有生物素的测试样品的布局，白色/透明底96孔微孔板中的阴性或阳性对照。 NC =阴性对照，PC =阳性对照，TS =测试样品

表2.每个孔的试剂组成

注意：有必要在几种稀释度下测试含生物素的样品，以确保生物素浓度在测定线性范围内，2-16μM的生物素（最终浓度）。注意：避免含有钾的缓冲液，因为它会在测定中引起沉淀。注意：必须通过凝胶过滤或透析将游离生物素与生物素化蛋白分离。

1.加入20μL含生物素的样品，阴性对照（ddH2O或用于溶解含生物素的样品的相同缓冲液）和阳性对照（组分C）到96孔白色/透明底微孔板中，如表1和2。

2.将180μLHABA/抗生物素蛋白测定溶液加入含有生物素的样品，阴性对照和阳性对照的每个孔中，使总生物素测定体积为200μL/孔。注意：对于比色皿格式，添加100μL样品和900μLHABA/抗生物素蛋白测定混合物。

3.将反应混合物在室温下孵育5分钟，在摇床上以100-200rpm摇动，避光，避免在移液过程中产生气泡。

4.用吸光度读板仪在500nm处监测吸光度降低。

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