将组织包埋在石蜡中进行免疫组织化学（AAT）

      免疫组织化学（IHC）是在组织形态学背景下监测蛋白质表达和定位的常用技术。它使用抗体来检测和分析蛋白质表达，同时保持天然组织的组成，细胞特征和结构。化学固定将细胞内和细胞间的分子相互作用锁定在适当的位置。组织样品可以包埋在石蜡中或冷冻，然后切成薄片并固定在载玻片上进行分析。组织的收集，保存和固定可能会因样品或感兴趣的目标而有很大差异。IHC通过特异性抗体结合来鉴定生物样品中蛋白质表达的存在和模式。抗体与其表位之间发生的结合可以检测蛋白质中靶向特定区域，结构域或切割产物的高特异性氨基酸序列。抗体还可以检测蛋白质上的特定翻译后修饰（PTM）。

      IHC用于疾病诊断，生物学研究和药物开发。例如，使用特定的肿瘤标记物，医生使用IHC来诊断肿瘤是良性还是恶性，确定其阶段和等级，并确定转移的细胞类型和起源，以便找到原发肿瘤的部位。使用IHC作为主要工具或确证程序，可以诊断出多种其他非肿瘤性疾病和病症。在研究背景下，IHC可以单独使用，也可以与其他分析技术结合使用，以研究例如正常组织和器官的发育，病理过程，伤口愈合，细胞死亡和修复以及许多其他领域。

 

样品制备

1.将石蜡浸润的组织放在带有少量液体石蜡的模具中。短暂冷却以固定组织，将纸盒放在模具上。装满液体石蜡，然后冷却。

2.在切片机上切成薄片，然后在水浴中漂浮切片。

3.将切片装在载玻片上并干燥过夜。

 

脱蜡/再水化

注：要进行抗体染色，必须从样品中除去石蜡，并且必须水化。过度干燥会导致不一致的染色。

1.除石蜡，将切片分别放在新鲜的二甲苯中3分钟。

2.开始再水化过程，请将切片放在两个100％乙醇的容器中，每次3分钟。

3.在两个装有95％乙醇的容器中孵育切片，每次1分钟。

4.将切片放在70％的乙醇中1分钟。

5.完成再水化过程，请在dH₂O中将切片洗两次，每次5分钟。

 

抗原提取

注意：请参阅产品数据表以获取有关抗体特异性方案。 过热或过热可能导致不一致的染色。

1.柠檬酸盐缓冲液：

在1X柠檬酸盐溶液中加热载玻片直至开始沸腾；然后在亚沸点温度（95℃-98℃）下持续20分钟。在工作台上冷却切片20分钟。

2.EDTA:

将载玻片在1mM EDTA（pH 8.0）中煮沸；然后在低于沸点的温度下加热15分钟。（无需冷却。）

3.TE:

将玻片在10mM Tris / 1mM EDTA（pH 9.0）中煮沸；保持沸腾温度18分钟。在室温下冷却30分钟。

 

染色

1.用dH₂O清洗切片3次，每次5分钟。

2.将切片在3％过氧化氢中孵育10分钟。（注意：此步骤对于淬灭内源性过氧化物酶活性很重要，这将有助于减少高背景染色）。

3.在dH₂O中清洗两次，每次5分钟。

4.为防止非特异性结合，请在室温下用的封闭溶液封闭每个切片30分钟。（使用相同物种的血清作为二抗的来源。）

5.除去封闭溶液，并以建议的稀释度添加一抗，以建议的稀释度添加到每个部分。

6.在4°C下孵育过夜。（应按照建议进行潜伏期。）

7.除去抗体溶液，并用洗涤缓冲液洗涤切片3次，每次5分钟。

8.在室温下用结合有HRP的二抗覆盖切片60分钟。

9.用清洗缓冲液清洗切片三遍，每次5分钟。

10.用即用的Stayright Purple覆盖部分。在室温下孵育5-15分钟。（孵育的具体时间根据自身实验而定）。

11.将切片浸入dH₂O，用dH₂O洗涤5-10分钟。

12.如果需要，对部分进行复染。

13.复染后，用dH₂O洗涤两次，每次5分钟。

 

脱水

1.将切片放在70％乙醇中2分钟。

2.将切片放在两个95％乙醇的容器中，每次1分钟。

3.将切片放在两个100％乙醇容器中，每个容器1分钟。

4.将切片放在两次二甲苯洗涤中，每次1分钟。

5.用盖玻片和有机性水性固定剂固定，注意避免导致气泡。

6.显微镜下观察。