百萤课堂：定量分析晚期细胞凋亡中DNA片段的直接方法

多细胞生物是由高度组织化的细胞群落组成的，为了这个细胞群落的茁壮成长，重要的是1.通过复杂的细胞过程，如细胞增殖和凋亡，2.建立稳态。这两个过程中任何一个过程的不适当转变都会导致疾病。例如，神经元凋亡活性的增加是各种神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症的根源。相反，凋亡机制的丧失会导致细胞过度生长，这是细胞癌变的潜在机制。总的来说，细胞凋亡在疾病中的作用是科学研究中的热门话题。

细胞凋亡

图1.概述了与细胞凋亡相关的所有参数。必须注意，这些事件不是按顺序发生的。它们中的许多将重叠，并且常常同时发生。事件1到4是凋亡的生化特征，不一定以细胞死亡结束。下游凋亡事件5到8是细胞发生凋亡的有力标志，此后细胞存活的可能性很小。

细胞凋亡是一种复杂的细胞程序性死亡途径。这种细胞自主活动过程的特点有几个不同的形态和生化标记，包括细胞和核收缩，染色质凝聚，细胞质膜泡和核DNA断裂。这些形态学变化都源于两种凋亡途径：外源性或内源性途径。外源性途径是由细胞外死亡受体配体（如肿瘤坏死因子（TNF）或Fas配体（FasL））的受体介导的途径。内源性途径是由环境应激引起的线粒体膜通透性和凋亡诱导因子（AIF）和细胞色素c的释放在细胞内诱导的。这两种途径的信号通过caspase级联传递，终导致caspase的核酸酶对细胞核DNA的下游消化。细胞凋亡的这些特征使得DNA片段分析能够作为识别细胞凋亡的终决定因素。

DNA片段的凋亡检测

目前有各种各样的技术可以用来来评估和鉴定凋亡DNA片段。早的检测方法是凝胶的DNA阶梯分析法，使用琼脂糖凝胶电泳来可视化和分离DNA片段。凋亡的DNA片段是一个独特的“梯状”模式的核体片段约180-200碱基对的长度。虽然该技术在生成定性数据方面很有效，但不适应高通量的应用。

另一种检测方法是用抗DNA和抗组蛋白抗体组成的双抗体夹心ELSIA法来观察细胞凋亡过程中DNA的断裂。尽管这种检测方法在检测凋亡DNA片段方面更为敏感，并且易于高通量使用（例如复合筛选），但它需要长时间手动操作，并且抗体的使用比较昂贵。

TUNEL测定

1992年，Gorczyca等人引入了一种新的用于DNA片段凋亡检测的方法，该方法利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和切口平移或TUNEL测定法测量凋亡性DNA片段化。TdT催化将荧光团标记的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到DNA双链断裂（DSB）的3'-羟基末端。

自从引入TUNEL检测法以来，它已成为一种广泛认可的用于鉴定凋亡细胞死亡的原位技术。 与以前的方法相比，TUNEL测定具有更灵敏的能力，可以在几个数量级上进行广泛的定量测量。 多年来，TUNEL技术已经针对显色和荧光检测方法进行了调整和优化。 荧光TUNEL检测利用与生物素偶联的dUTP和酶标记的抗生蛋白链菌素进行高灵敏度染色。 荧光检测方法依赖于荧光染料偶联的dUTP，可直接检测DNA片段。

影响TUNEL染色的因素有许多。其中一些变量包括试剂浓度、样品固定和DNA链断裂后的末端连接等，这些可能因组织或细胞样品类型而异。

Cell Meter TUNEL细胞凋亡检测

AAT Bioquest的Cell Meter TUNEL细胞凋亡测定法针对荧光检测进行了优化，可用于绿色或红色荧光发射。 AAT Bioquest的Cell Meter 检测包括所有必需成分和实验方案，可以检测和定量细胞中凋亡的DNA片段。 通过使用TdT将荧光染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸核苷酸（Tunnelyte Green或Tunnelyte Red）催化并入DNA的3'OH末端，来检测凋亡的DNA片段。 然后可以通过流式细胞仪定量标记的DNA片段，或通过荧光显微镜直接观察。

图2.用诱导凋亡的化学物质星形孢菌素（SS）处理HeLa细胞中TUNEL反应的荧光图像。 与未处理的对照相比，将HeLa细胞用100 nM或1μMSS处理4小时。 将细胞与反应混合物在37ºC下孵育1小时。 使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜分析绿色荧光信号。 荧光标记的DNA链断裂在SS处理的细胞中表现出强烈的荧光。

Tunnelyte™绿色的497 nm峰值吸收非常适合通过配备488 nm氩离子激光线的仪器进行有效激发。对于发射滤波片的选择，可以分别使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）滤波片读取Tunnelyte™绿色或Tunnelyte™红色。 由于Tunnelyte™核苷酸已与蓝色光谱充分分离，因此DAPI，Hoechst或Nuclear Violet LCS1等染色剂适用于多色荧光应用中的活细胞复染。

图3.左：Tunnelyte Green的吸收和发射光谱。 激发波长为488 nm（蓝色激发光线）。 带有发射滤光片FITC的Tunnelyte Green读数（绿色波段）。右：Tunnelyte Red的吸收和发射光谱。 激发波长为561 nm（绿色激发光线）。 带有发射滤光片Cy5的Tunnelyte Red读数（红色波段）。

我们的Cell Meter TUNEL细胞凋亡检测试剂盒比其他市售TUNEL检测试剂盒具有明显的优势，因为我们的试剂盒在反应缓冲液中不含二甲基胂酸钠或钾。 不含二甲基胂酸钠或钾有两个好处，首先，它要得多。其次，它提供了更灵敏，准确的凋亡检测方法。二甲基胂酸钠是一种致癌的砷衍生物，由于摄入，吸入或皮肤接触而具有剧毒。由于毒性，它可以诱导细胞凋亡，在测定中测量细胞凋亡时不可避免地会导致细胞信号干扰。

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