trFluor Eu琥珀酰亚胺酯
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trFluor Eu琥珀酰亚胺酯是美国AAT Bioquest生产的荧光染料，在细胞、血清或其他生物流体中的许多生物化合物是天然发光的，因此使用常规的快速荧光团导致测定灵敏度的严重限制，这是由于待测定的生物分子的自发荧光引起的高背景。使用长寿命荧光团结合时间分辨检测（激发和发射检测之间的延迟）可以大限度地减少瞬间荧光干扰。 AAT Bioquest的trFluor Tb和trFluor Eu蛋白探针可为需要高灵敏度的分析启用时间分辨荧光测定（TRF）。与更传统的荧光团如Alexa Fluor或花青染料相比，这些trFluor 探针具有较大的斯托克斯位移和极长的发射半衰期。与其他TRF化合物相比，我们的trFluor Eu和trFluor Tb探针具有相对高的稳定性，高发射产率和与生物分子相关的能力。此外，我们的trFluor Eu和trFluor Tb探针在与抗体等生物聚合物结合时对荧光猝灭不敏感。
琥珀酰亚胺基（NHS）酯被证明是用于胺修饰的佳试剂，因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时，需要考虑的因素很少：1）溶剂：在大多数情况下，活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中。 2）反应pH：胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应，包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的氨基基团。因此，胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。 3）反应缓冲液：当使用胺反应试剂时，必须避免使用含有游离胺如Tris和甘氨酸和硫醇化合物的缓冲液。在进行染料结合之前，还必须除去广泛用于蛋白质沉淀的铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）（例如通过透析）。 4）反应温度：大多数缀合在室温下进行。然而，对于特定的标记反应，可能需要升高或降低的温度。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的trFluor Eu琥珀酰亚胺酯。
样本标记步骤
注意：该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与trFluor Eu SE的缀合物开发的。请根据您的具体实验进行调整。
1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：
将100L反应缓冲液（例如，1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900L目标蛋白质溶液（例如抗体，蛋白质浓度> 2mg / ml，如果可能）混合，得到1 mL蛋白标记储备液。
注意1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。 如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注意2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注意3：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好标记。 叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。 可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得标记结果。
注意4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率显着降低。 为获得标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到小瓶trFluor?Eu SE中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液B），需及时使用。染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮湿的情况下储存在冰箱中两周。避免冻融循环。
3.确定染料/蛋白质比例（可选）：
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。 蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质结合物会降低灵敏度。 我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。 通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。
3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。 蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。 假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。
3.2运行结合反应（见下面的步骤4）。
3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1; 分别为15：1和20：1。
3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。
3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比例（DOS）（见下文）。
3.6运行上述4种结合物的功能测试，确定的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。
4.运行结合反应：
4.1在有效摇动下，将适量的染料储备溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的摩尔比由步骤3.6确定。 如果跳过步骤3，我们建议使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）。
4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
5.纯化缀合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。
5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。
5.2将反应混合物（直接来自步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。
5.3一旦样品在顶部树脂表面下方运行，加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4将更多PBS（pH 7.2-7.4）加入所需样品中以完成柱纯化。 合并含有所需染料 - 蛋白质缀合物的级分。
注意1：立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。
注意2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥（见说明书）。
参考文献
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