Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒*蓝色荧光*

Cell Meter TUNEL细胞凋亡测定试剂盒是一种强大的工具，可方便地检测由DNA片段化引起的细胞凋亡。该测定是非放射性且快速的。TUNEL分析使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化DEAC-dUTP在片段DNA的游离3'-羟基末端的掺入。通过荧光显微镜（AMC滤波片组）分析所得的DEAC标记的DNA。它的蓝色激发光可以方便地与GFP标记的靶标多路复用。荧光DEAC标记的核苷酸的直接掺入可明显减少检测步骤。该试剂盒经过优化，可检测固定细胞和福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中的凋亡。

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流式细胞仪
Ex:	405 nm
Em：	525/50  nm
通道:	Pacific Orange  通道

 

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荧光显微镜
Ex:	Violet 滤波片组
Em：	Violet 滤波片组
推荐孔板:	黑色透明底板

样品分析方案

概述

根据需要处理样品

在冰上用4％甲醛溶液固定细胞30分钟

在冰上用70％冰冷的乙醇透化细胞60分钟

将TdT染色溶液添加到样品中并在37°C下孵育60分钟

使用带有Violet滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度 

 

工作溶液配制

 

操作步骤

以下方案可用作参考，实际情况应根据需要进行调整。

1. 根据需要处理样品。
2. 用您选择的缓冲液（例如含Ca ⁺²和Mg ^+2的 PBS）洗涤样品。
3. 通过在PBS中加入100 µL 4％多聚甲醛固定样品，并在冰上孵育30分钟。
4. 除去固定液并用PBS洗涤样品。
5. 向样品中加入100 µL 70％的冰冷乙醇，并在冰上孵育60分钟。
   注意：样品在使用前可以在-20°C下保存几天。
6. 除去酒精并用PBS洗涤细胞。
   注意：对于阳性对照，将固定样品与2-5 µg / mL DNAse在含有Ca ⁺²和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse并彻底清洗细胞，并继续进行其余操作。
7. 向样品中加入50µL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。
8. 除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤样品。
9. 将样品重悬于PBS中，并使用流式细胞仪使用525/50 nm滤光片（Pacific Orange通道）或带有紫色滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度。 

 

以下方案可用作参考，实际应根据需要进行调整。
去石蜡和水化

1. 通过将载玻片在Coplin广口瓶中在室温下浸入新鲜的二甲苯中5分钟，从而对组织切片（附着在载玻片上）进行脱蜡。再重复一次。（共2次洗涤）
2. 将载玻片在室温下在Coplin广口瓶中浸入100％乙醇中5分钟，以洗涤样品。
3. 通过在室温下将载玻片浸入各种浓度的酒精（100、95、85、70、50％）中，分别在室温下浸泡5分钟，从而对样品进行水化处理。
4. 在室温下将载玻片浸入0.85％NaCl中5分钟，以洗涤样品。
5. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤） 

固定

1. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
2. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤）
3. 除去液体，然后将载玻片放在平坦的地方。用100 µL 20 µg / mL蛋白酶K溶液处理组织切片。（添加至足够覆盖整个组织表面。在室温下孵育载玻片10分钟。）
4. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。
5. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
6. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤） 

染色

1. 可选：对于阳性对照，将固定的样品与2-5 µg / mL的DNAse在含有Ca ⁺²和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse，并用PBS彻底清洗细胞，并继续进行其余操作。
2. 向样品中加入50 µL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。
3. 除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤样品。
4. 加入封固剂，并用带紫色滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度。 

 

图示

图1.用   HeLa细胞进行TUNEL分析的荧光图像。 固定HeLa细胞，并在37°C下分别使用和不使用DNAse处理60分钟。然后将细胞用Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒（Cat＃22855）染色。DNA链断裂在DNAse处理的细胞中表现出强烈的荧光染色。使用紫色滤光片组在荧光显微镜下检测信号。  

 

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