Bucculite XdU细胞增殖检测试剂盒*红色荧光兼容**流式细胞术*

检测细胞增殖是评估细胞活力、细胞周期和遗传毒性的可靠的方法之一。 该试剂盒采用的是检测细胞增殖的一种基本方法，它是在细胞生长的S期过程中，在存在胸腺嘧啶核苷的情况下检测DNA的合成。 Bucculite 流式细胞术XdU细胞增殖测定试剂盒使用XdU，该XdU在DNA合成过程中被掺入细胞DNA中。 固定细胞后，将掺入的XdU用iFluor 647叠氮化物标记。 在APC通道中观察iFluor 647标记的DNA。 Bucculite 流式细胞术XdU细胞增殖检测试剂盒是抗BrdU抗体的检测和EdU点击化学检测的的替代品。 它的灵敏度非常高，可用于在单细胞水平上检测活性DNA的合成。

样品实验方案

概述

准备细胞
使用XdU工作溶液处理细胞3小时
固定细胞
透化细胞
用Bucculite 工作溶液处理细胞30分钟
在流式细胞仪中使用660/20 nm滤光片组观察荧光

溶液配制

1.储备溶液配制

1.1 XdU储备溶液（100X）
将XdU（组分A）溶于200 µL DMSO中制成XdU储备溶液。
注意：可以将剩余的XdU储备溶液以较小的等分试样在-20°C下存储。
注意：避免光线直射，并避免重复的冻融循环。

1.2iFluor 647叠氮化物储备溶液（200 X）
将iFluor 647叠氮化物（组分B）溶于100 µL DMSO中，制成iFluor 647叠氮化物储备溶液。
注意：可以将剩余的iFluor 647叠氮化物储备溶液以较小的等分试样在-20°C下存储。
注意：避免光线直射，并避免重复的冻融循环。

1.3XdU反应添加剂储备溶液（20X）
将XdU反应添加剂（组分E）溶于1 mL去离子水中，制成XdU反应添加剂储备溶液。
注意：剩余的XdU反应添加剂储备溶液可以在-20°C下保存。

2.工作溶液配制

2.1XdU工作溶液配制
在1 mL细胞培养基中加入10 µL 100X XdU储备溶液，制成XdU工作溶液。
注意：1 mL的工作溶液足以进行5次检测。
注意：此100X浓度是使用优化的XdU浓度在HeLa和Jurkat细胞中测试的。 生长培养基、细胞密度、细胞类型变化和其他因素可能会影响标记。 我们建议检测一系列XdU浓度，以确定佳浓度以及是否适合您的细胞等因素。

2.2Bucculite 工作溶液
按以下顺序混合并充分涡旋
①905 µL染色缓冲液（组分C）
②40 µL CuSO4（组分D）
③5 µL iFluor 647叠氮化物储备溶液
④50 µL XdU反应添加剂储备溶液
注意：1 mL的Bucculite 工作溶液足以进行5次检测。

操作步骤

1.用XdU标记细胞
考虑到细胞在200 µL细胞培养基中，请向细胞中加入200 µL XdU工作溶液。
在适合细胞类型的佳条件下，将细胞孵育3小时。 XdU在细胞中的时间可以直接检测细胞DNA的合成。 孵育时间取决于细胞生长速率。

2.细胞固定
孵育后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞一次。
注意：清洗步骤后，如果使用贴壁细胞，请使用ReadiUse 细胞分离缓冲液（#60010）分离它们。
向每个试管中加入200 µL的固定缓冲液（含3.7%甲醛的PBS溶液，未提供），并在室温下孵育15-20分钟。
除去固定液，并用PBS清洗每个试管中的细胞两次。

3.细胞通透性处理
向每个试管中加入200 µL透化缓冲液（0.5％Triton®X-100的PBS溶液，未提供），并在室温下孵育10-20分钟。
除去通透缓冲液，并用PBS清洗每个试管中的细胞两次。

4.细胞染色
在试管中加入200 µL Bucculite 工作溶液。 在室温避光下，将Bucculite 工作溶液在室温下孵育细胞30分钟。
除去每个管中的Bucculite 工作溶液。
用PBS洗涤细胞两次，洗涤后加入200 µL PBS。
在流式细胞仪中使用660/20 nm滤光片观察细胞中的荧光信号。

图示

图1.用Buccutite XdU细胞增殖检测试剂盒（Cat＃22325）检测到的S期Jurkat细胞的流式细胞仪中的反应。 将Jurkat细胞以50,000个细胞/孔/ 100μL的浓度接种在6孔黑色板上过夜。 按照说明书，将细胞在37℃下用XdU处理3小时，固定并透化。 然后将细胞在染色缓冲液中用iFluor 647叠氮化物染色30分钟，并用PBS洗涤3次。 使用APC通道，通过NovoCyte流式细胞仪检测荧光响应。