iFluor Ultra 594 琥珀酰亚胺酯

荧光染料缀合抗体是许多应用中鉴定蛋白质的一种工具，包括荧光细胞成像、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学等。使用荧光标记抗体的优势包括更高的灵敏度、多路复用能力和易用性。 iFluor Ultra 系列是我们广受欢迎的 iFluor 染料的新升级版，并针对用于荧光成像和流式细胞术应用的标记抗体进行了优化。用 iFluor Ultra 594 制备的抗体缀合物远远优于其他现有类似染料的缀合物，如 Alexa Fluor® 594。iFluor Ultra 594 缀合物在相同条件下比用 Alexa Fluor® 594 制备的缀合物更亮。此外，iFluor Ultra 594 的荧光不受 pH (4-10) 的影响。 iFluor Ultra 594 SE 染料相当稳定，并表现出与蛋白质氨基的良好反应性和选择性。 iFluor Ultra 594 的光谱特性和反应性类似于 Alexa Fluor® 594（Alexa Fluor® 是 ThermoFisher 的商标）。

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实验方案

储备溶液配制

1. 蛋白质原液（溶液 A）
将 100 µL 反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液，pH ~ 9.0）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白质浓度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记原液。
注意：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，则使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调整到 8.0-9.0 的范围内。
注意：蛋白质应溶于1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须用 1X PBS，pH 7.2-7.4 进行透析，以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。
注意：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，缀合效率会显着降低。为获得标记效率，建议蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

2. iFluor Ultra 594 SE 原液（溶液 B）
将无水 DMSO 添加到 iFluor Ultra 594 SE 小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液 B），并及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存两周，避免冻融循环。

  

操作步骤

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor Ultra 594 SE 的缀合而开发的。 您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意：每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。 蛋白质的过度标记会对其缀合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

1.进行缀合反应
1.1使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比作为起点：将 5 μL 的染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）在有效摇动下倒入蛋白质溶液（95 µL 溶液 A）小瓶中。 假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。
注意：我们建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）。 如果太低或太高，分别确定染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。
1.2在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

 

2.纯化缀合物
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱进行染料-蛋白质缀合物纯化的示例。
根据制造说明准备 Sephadex G-25 柱。
2.1将反应混合物（来自“1.进行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 列的顶部。
2.2样品刚好在顶部树脂表面下方运行时，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
2.3向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。 结合含有所需染料-蛋白质偶联物的组分。
注意：要立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
注意：对于长期储存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

3.数据处理

3.1表征所需的染料-蛋白质缀合物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的重要因素。 较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的蛋白质（例如 DOS > 6）也往往具有较低的荧光强度。 大多数抗体的 DOS 建议在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。 为了有效标记，应控制取代度，使 6-8 摩尔 iFluor Ultra 594 SE 对 1 摩尔抗体。 以下步骤用于确定 iFluor Ultra 594 SE 标记蛋白质的 DOS。

3.2吸收检测
要检测染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，建议将样品浓度保持在 1-10 µM 的范围内，具体取决于染料的消光系数。

3.3读取 280 nm 处的 OD（吸光度）和染料大吸光度（对于 iFluor Ultra 594 染料，ƛmax = 588 nm）
对于大多数分光光度计，样品（来自色谱柱馏分）需要用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范围内。 OD（吸光度）在 280 nm 是蛋白质的大吸收，而 588 nm 是 iFluor Ultra 594 SE 的大吸收。 要获得准确的 DOS，请确保缀合物中不含非结合染料。

3.4计算DOS
您可以通过链接使用我们的工具计算DOS

 

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