Amplite 马来酰亚胺快速定量试剂盒 比色法

Amplite 马来酰亚胺快速定量试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于胺定量的试剂盒，具有马来酰亚胺基团的各种交联剂广泛用于将蛋白质与蛋白质或蛋白质交联至其他生物分子。马来酰亚胺交联技术的关键点是与单一蛋白质或抗体连接的马来酰亚胺的定量。马来酰亚胺可以在302nm下通过分光光度法直接测定。然而，620M-1cm-1的小消光系数使得该测定不敏感，并且该测定由于在相同波长下的蛋白质吸光度而进一步复杂化。 AAT Bioquest的Amplite 快速比色马来酰亚胺定量试剂盒使用我们专有的马来酰亚胺传感器Maleimide Blue ，在~780nm处具有大吸光度，可快速准确地量化马来酰亚胺。该测定的原理是马来酰亚胺蓝 与马来酰亚胺连接的样品反应，并且所得产物通过单个旋转柱以除去过量的传感器。测量纯化产物的吸收光谱，并且可以从780nm和280nm（对于蛋白质）或260nm（对于寡核苷酸和核酸）的吸光度比计算马来酰亚胺与蛋白质的比率。这种Amplite 快速马来酰亚胺定量试剂盒可在传统的比色皿，NanoDrop 分光光度计或方便的96孔吸光板读数器中进行，带有UV透明板。该试剂盒已广泛用于从蛋白质，寡核苷酸和核酸样品中快速定量马来酰亚胺基团。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 马来酰亚胺快速定量试剂盒。

实验方案

1.准备样品溶液：

1.1使用50至100μg马来酰亚胺样品（蛋白质或其他聚合物）。

1.2使用分析缓冲液（组分B）将体积调节至100μL。 注意：马来酰亚胺连接的抗体或蛋白质样品应在pH = 6.0缓冲液中且不含游离马来酰亚胺。

 

2.运行马来酰亚胺测定：

2.1将马来酰亚胺样品加入一瓶马来酰亚胺蓝（组分A）中。

2.2通过反复移液几次将其混合均匀，或将小瓶涡旋几秒钟。

2.3将反应混合物保持在室温下并旋转或摇动30-60分钟。

 

3.准备用于样品纯化的旋转柱：

3.1将旋转柱（组分C）反转几次以重悬沉淀的凝胶并除去任何气泡。

3.2取下尖端并将色谱柱放入洗涤管（2 mL，组分D）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

3.3在1000 x g的摇摆式离心机中离心1分钟（参见“离心注释”部分）以除去包装缓冲液。丢弃缓冲区。

3.4将1 mL分析缓冲液（组分B）应用于色谱柱，让缓冲液通过重力排出，或将色谱柱离心1分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

3.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见离心注释部分）以除去反应缓冲液。丢弃缓冲区。注意：旋转柱（组分C）可以装入2 mL微量离心管或12 x 75 mm试管中，以便在离心过程中收集样品。使用随柱提供的2 mL微管进行初始色谱柱平衡步骤。注意：能够产生1,000 x g最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。或者，使用公式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。

RCF（g）=（1.12×10-5）×（RPM）2×r

RCF =相对离心力
RPM =转子的速度
r =从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径

 

4.纯化Malemide反应产物：

4.1将色谱柱放入干净的收集管（1.5 mL，组分E）中。 小心地将样品（100μL）直接加载到色谱柱中心。

4.2加载样品后，在顶部加入10μL分析缓冲液（组分B），以1,000 x g离心柱5分钟，然后将溶液收集到收集管中。

 

5.用0.2mL或0.5 mL石英比色皿运行吸收光谱：

5.1根据所用的比色皿大小和吸光度读数，用测定缓冲液（组分B）将马来酰亚胺反应产物稀释5-10倍。 稀释因子不影响最终的马来酰亚胺定量结果。

5.2测量900 nm至250 nm范围内的吸收光谱，或仅读取280 nm和782 nm处的吸光度数。

 

示例分析

使用BSA-马来酰亚胺作为实例，用0.5mL比色皿测量计算马来酰亚胺连接的BSA样品上的马来酰亚胺基团的数目。

样品：BSA-马来酰亚胺，10.75mg / mL，pH = 6.0缓冲液

 

1.使用4.7μL（50μg）BSA-马来酰亚胺，然后加入95.3μL分析缓冲液（组分B），使总体积为100μL。
2.将100μL以上溶液加入到马来酰亚胺蓝TM小瓶（组分A）中，充分混合。
3.在室温下旋转60分钟。
4.用旋转柱（组分C）纯化，并收集产物。
5.取50μL产物，加入400μL分析缓冲液（组分B）至0.5mL比色皿中并测量吸光度光谱。

 

常数：

BSA在280nm处的消光系数：43824M-1cm^-1
最大吸收（780±3nm）时的马来酰亚胺Blue 消光系数：275,000 M-1 cm^-1
马来酰亚胺蓝 在280nm（CF280nm）的校正因子：0.207

 

结果：

用上述BSA-马来酰亚胺样品获得的OD读数：A280nm = 0.290，A782nm = 1.214

 

计算：

用以下公式计算BSA-马来酰亚胺量：

（马来酰亚胺的摩尔数）/（蛋白质或抗体的摩尔数）=
（[A782nm] /εMaleimideBlue ）/ [（A280nm-CF280nm x [A782nm]）/ε蛋白或抗体在280nm处]

马来酰亚胺比=（1.214 / 275000）/（0.290 - 0.207×1.214）/ 43824 = 5.00

 

参考文献

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Journal: Journal of Controlled Release (2013): 382--389

 

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