ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒

ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒是美国AAT Bioquest生产的生物素偶联试剂盒，生物素广泛用于标记生物分子，特别是抗体。 我们的ReadiLink 蛋白质生物素化试剂盒经过优化，可用于制备用于酶免疫测定（EIA）的生物素标记的IgG。 它使用与IgG和其他生物分子的氨基反应的生物素琥珀酰亚胺酯。 该试剂盒配有所有必需的标记和纯化试剂。 在我们的手上，根据IgG分子上可用的分子量和赖氨酸残基，可以将3至6个生物素分子与每个IgG分子缀合。 该试剂盒可用于2种缀合反应。 对于每个缀合反应，该材料可以标记高达1mg蛋白质。 整个过程只需不到一个小时。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒。 

样品实验方案

简要概述

将20μl反应缓冲液（组分B）加入目标蛋白（200μl）中
将蛋白质溶液添加到ReadiLink Biotin SE（组分A）中
在室温下孵育30-60分钟
通过旋转柱纯化缀合物

工作溶液配制

蛋白质工作溶液配制方案：
为了标记1mg靶蛋白（假设目标蛋白浓度为5mg / mL），将20μL（总反应体积的10％）的反应缓冲液（组分B）与200μL目标蛋白溶液混合。注意：如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~1 mg蛋白质可用于此标记反应。注意：蛋白质溶液的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用反应缓冲液（组分B）或饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至8.0-9.0的范围。注意：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。注意：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体可能效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得最佳标记结果。注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

操作步骤

1.进行结合反应

1.1将蛋白质工作溶液加入到ReadiLink 生物素SE（组分A）的小瓶中，通过反复移液几次将其充分混合，或者将小瓶涡旋几秒钟。

1.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

2.准备旋转柱进行样品纯化

2.1将提供的旋转柱（组分C）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并除去任何气泡。

2.2取下尖端并将色谱柱放入洗涤管（2 mL，未提供）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心1分钟（参见“离心注释”部分）以除去包装缓冲液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。

3.纯化缀合物

3.1将色谱柱（从步骤准备旋转柱进行样品纯化）放入干净的收集管（1.5 mL，未提供）中。 小心地将样品（100-500μL，来自步骤缀合反应）直接加载到色谱柱中心。

3.2加载样品后，加入300μL1XPBS（pH 7.2-7.4），使总体积为220μL至520μL。 将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需生物素标记蛋白的溶液。

4.蛋白质缀合物的储存

4.1抗体缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。 当在2mM叠氮化钠存在下储存并且避光时，缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。 为了更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-60℃下储存。

5.离心注意事项

5.1旋转柱（组分C）可以装入2mL微量离心管或12×75mm试管中，用于在离心过程中收集样品。 使用2 mL微管和色谱柱进行初始色谱柱平衡步骤。

5.2能够产生1,000 x g的最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。 在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。 有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。 或者，使用以下等式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。

5.3RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相对离心力，r是从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径 ，RPM是转子的速度）。

数据分析

图1. ReadiLink 蛋白质生物素化试剂盒的化学结构

参考文献

A low-cost, high-performance system for fluorescence lateral flow assays
Authors: Linda G Lee, Eric S Nordman, Martin D Johnson, Mark F Oldham
Journal: Biosensors (2013): 360--373

Implementation of P22 viral capsids as nanoplatforms
Authors: Sebyung Kang, Masaki Uchida, Alison O’Neil, Rui Li, Peter E Prevelige, Trevor Douglas
Journal: Biomacromolecules (2010): 2804--2809

Calcium-dependent activation of transglutaminase 2 by nanosecond pulsed electric fields
Authors: Keiko Morotomi-Yano, Ken-ichi Yano
Journal: FEBS Open Bio

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