iFluor 647 酪胺信号放大成像试剂盒（iFluor 647 PSA Imaging Kit），含有山羊抗兔IgG
| Ex (nm) | 656 | Em (nm) | 670 |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
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货期： 咨询 |
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适用范围： 该产品适合标记抗体或蛋白。应用于细胞或组织。 |
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产品优势： 1.灵敏度更高； 2.荧光信号更强，比tyramide（TSA）试剂高10-50倍； 3.是Alexa Fluor 647酪胺试剂盒、TSA试剂盒等其他光谱相似酪胺试剂盒的替代品； |
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简介： iFluor 647 酪胺信号放大成像试剂盒（iFluor 647 PSA Imaging Kit），是一种用于荧光信号放大的产品，它通过HRP和过氧化氢催化，标记到抗体上。 |
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注意事项： 该产品不能进行活体成像。 |
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| 查看光谱 | |
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适用仪器： |
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| 荧光显微镜 | |
| Ex: | Cy5滤波片组 |
| Em： | Cy5滤波片组 |
| 推荐孔板: | 黑色透明底板 |
| 滤波片： | Cy5滤波片组 |
样品实验方案
简要概述
- 修复/透化细胞或组织
- 在封闭缓冲液中添加一抗
- 加入HRP标记的二抗
- 准备Styramide工作溶液，并在室温下添加到细胞或组织中（5-10分钟）
溶液配制
储备溶液配制
1.Styramide 储备溶液（100X）
将100 µL DMSO加入iFluor 染料标记的Styramide 缀合物（组分A）的小瓶中，制成100X Styramide 储备溶液。
注意：一次性使用等分试样，将未使用的100X储备溶液在2-8℃的冰箱避光保存，并避免反复冻融。
2.H2O2溶液（100X）
向9 mL的ddH2O中添加1 mL的3％过氧化氢（组分E）。
注意：在使用当天新配制的100X H2O2溶液。
工作溶液配制
1.Styramide 工作溶液（1X）
每1 mL反应缓冲液需要10 µL Styramide 储备溶液和10 µL H2O2 储备溶液。
注意：1.按照每个盖玻片或96孔板中的每孔需要100µL Styramide工作溶液来计算，可以进行100次测试。
2.Styramide 工作溶液必须在制备后2小时内使用，并避免直接暴露在光线下。
2.二抗-HRP工作溶液
在含1％BSA的PBS中以1：100稀释100X二级抗体-HRP储备溶液。
注意： 此试剂盒中提供的二抗HRP足以用于100μL HRP工作溶液/盖玻片或96孔板中的每孔进行100次测试。
实验步骤
（该步骤适用于细胞或组织染色）
细胞固定和透化
1.在室温下用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定细胞或组织20分钟。
2.用PBS冲洗细胞或组织两次。
3.在室温下用0.1％Triton X-100溶液透化细胞1-5分钟。
4.用PBS冲洗细胞或组织两次。
组织固定，脱石蜡和补液
（根据标准IHC方案对组织进行脱蜡和脱水处理。根据实验方案使用特定溶液进行抗原修复。）
过氧化物酶标记
1.可选：在过氧化物酶淬灭溶液（例如3％过氧化氢）中孵育细胞或组织样品10分钟，淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下用PBS冲洗两次。
2.可选：如果使用结合HRP的链霉亲和素，建议通过生物素封闭缓冲液封闭内源性生物素。
3.在4°C下用封闭溶液（例如含1％BSA的PBS）封闭30分钟。
4.除去封闭溶液，并添加稀释好的一抗，在室温下放置60分钟或在4°C下放置过夜。
5.用PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.将100 µL二抗-HRP工作溶液添加到每个样品中，并在室温下孵育60分钟。
注意：孵育时间和浓度可以根据信号强度而变化。
7.用PBS洗涤3次，每次5分钟。
Styramide标记
1.向每个样品中添加100 µL Styramide 工作溶液，并在室温下孵育5-10分钟。
注意：如果您观察到非特异性信号，则可以缩短Styramide的孵育时间。在不同的孵育时间点使用阳性和阴性对照确定样品的孵育时间，或者在工作溶液中使用较低浓度的Styramide。
2.用PBS冲洗3次。
复染和荧光成像
1.根据需要对细胞或组织样本进行复染。AAT提供了一系列核复染色试剂，如表1所示。请按照试剂说明进行操作。
2.加上盖玻片。
3.使用适当的滤波器观察Styramide的荧光信号。
表1.建议用于核复染色的产品。
| 货号 | 产品名称 | Ex/Em(nm) |
| 17548 | 核蓝 DCS1 | 350/461 |
| 17550 | 核绿 DCS1 | 503/526 |
| 17551 | 核橙 DCS1 | 528/576 |
| 17552 | 核红 DCS1 | 642/660 |
图示
 图1.Power Styramide 信号放大（PSA）系统是可以检测细胞和组织中极低丰度的靶标灵敏的方法之一，其荧光信号强度比广泛使用的tyramide（TSA）试剂高10-50倍。与iFluor染料结合使用后具有更高荧光强度、更高的光稳定性和增强的水溶性，iFluor染料标记的Styramide缀合物可以产生比标准ICC /明显更高的精度和灵敏度（超过100倍）的荧光信号。PSA利用辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性原位共价沉积荧光团。PSA自由基的反应性比酪酰胺自由基高得多，这使PSA系统比传统的TSA试剂更快，更耐用，更灵敏。 |
 图2.用兔抗Tubulin一抗标记的HeLa细胞的荧光图像。然后将细胞分别用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗和iFluor Styramide（左）或AlexaFluor 350酪酰胺（中和右）染色。使用DAPI滤光片组拍摄荧光图像，并相应标记曝光时间。在相同的曝光时间（25毫秒）下，iFluor 350 Styramide 显示出比AlexaFluor 350酪酰胺明显更高的荧光强度。AlexaFluor 350酪酰胺需要更长的曝光时间（125毫秒）才能使染色可视化。 |
 图3.使用iFluor PSA 成像试剂盒对甲醛固定，对石蜡包埋的人肺腺癌进行顺序免疫染色。用兔抗EpCam抗体和带有山羊抗兔IgG的iFluor 488 PSA 成像试剂盒标记EpCam，然后洗涤。Pan-Keratin用小鼠抗Pan Keratin抗体标记、iFluor 555 PSA 成像试剂盒带有山羊抗小鼠IgG标记。细胞核用DAPI标记。在共聚焦显微镜上采集图像。 |
