Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒 红色荧光
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测蛋白激酶的试剂盒，大多数的商品化蛋白激酶检测试剂盒不是基于对形成的磷酸肽进行检测，就是对ATP的减少量进行检测。使用基于对磷酸肽进行检测的激酶检测试剂盒，需要花大量的时间和精力去选择一种多肽底物；而运用基于对ATP减少量的检测法则容易受到许多干扰，因为荧光素酶容易受多种生物化合物的抑制。Amplite 通用激酶检测试剂盒检测机制是基于对形成的ADP进行检测，它与磷酸转移酶的活性成直接的比例关系，并且可以通过荧光法检测。本试剂盒提供了一种快速、简单、均一的激酶活性检测法。它具有高灵敏度(<0·2 uM ADP)、宽ATP耐受性(1-300 uM)，不基于抗体，无发射性和不需洗脱就可以对酶催化产生的总ADP进行检测，这些特性使它成为检测激酶米氏方程动力学，筛选和鉴定激酶抑制剂的一种理想试剂盒。本检测法可以便捷地用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步操作就可以轻易地实现自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 激发： | 540nm |
| 发射： | 590nm |
| cutoff: | 570nm |
| 推荐孔板： | 黑色孔板 |
样品实验方案
简要概述
运行激酶反应（20μL）
添加ADP传感器缓冲液（20μL）
添加ADP传感器工作溶液（10μL）
在室温下孵育15分钟--1小时
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570nm）
溶液配制
1.储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. 1ADP Sensor I储备溶液（50X）：
将50μLDMSO（组分B3）加入到ADP传感器1（组分B1）的小瓶中，制备50X ADP传感器I储备溶液。
1.2ADP标准溶液（300 mM）：
向ADP标准品（组分C）中加入100μLDdH2O，制成300mM ADP标准溶液。
2.标准溶液配制
ADP标准配制
取300 mM ADP标准溶液，在激酶反应缓冲液中稀释10,000倍，制成30μMADP标准溶液。 取30μMADP标准溶液，在激酶反应缓冲液中进行1：3连续稀释，得到ADP标准溶液的连续稀释液。 注意：通过包含不含ADP的样品来测量背景荧光，在激酶反应缓冲液中连续稀释ADP标准品。
3.工作溶液配制
将50μL50XADP Sensor I储备溶液加入到ADP Sensor II（组件B2）的样品瓶中，制成ADP Sensor工作溶液。 注意：重组的ADP不稳定，可根据需要制作新鲜溶液，随用随配。
操作步骤
1.运行激酶反应（此步骤不提供试剂）：
1.1根据需要制备20μL（或对于384孔板10μL）激酶反应溶液/孔。 应根据需要优化激酶反应的组分（例如，特定激酶反应可能需要优化的缓冲系统）。 在大多数情况下，如果您没有优化的激酶缓冲液，ADP检测缓冲液（组分D）也可用于运行激酶反应。
1.2Amplite 荧光激酶检测试剂盒用于确定ADP的形成。
2.运行Amplite ADP分析：
2.1将20μLADP缓冲液（组分A）和10μLADP工作溶液加入每个充满20μL激酶反应溶液的孔中，使总ADP测定体积为50μL/孔。 对于384孔板，在每个充满10μL激酶反应溶液的孔中加入10μLADP传感器缓冲液（组分A）和5μLADP，使总ADP测定体积为25μL/孔。
2.2将反应混合物在室温下孵育15分钟至1小时。
2.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光强度。
3.生成ADP校准曲线（筛选激酶抑制剂不需要）：
3.1添加20μL（对于96孔板）或10μL（对于384孔板）/孔ADP传感器缓冲液（组分A）和10μL（对于96孔板）或5μL（对于384） （间隔板）ADP传感器进入连续稀释的ADP标准品的每个孔中，使每个反应的总体积为50μL（对于96孔板）或25μL（对于384孔板）。
3.2将反应混合物在室温下孵育15分钟至1小时。
3.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光强度。
3.4生成ADP标准曲线。
数据分析
从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算ADP剂量样本。
| 图1.使用Gemini荧光酶标仪（Molecular Devices），在实心黑色384孔板中用Amplite Universal Fluorimetric Kinase Assay Kit测量ADP剂量反应。 |
参考文献
ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion
Authors: Lei Lang, Yixuan Hou, Yanlin Chen, Gang Tu, Jing Tao, Dan Yang, Lei Xi, Lixin Fu, Kexin Sun, Jiali Yin
Journal: Cellular Physiology and Biochemistry (2018): 2972--2988
Discovery of Non-ATP-Competitive Inhibitors of Polo-like Kinase 1
Authors: Taikangxiang Yun, Tan Qin, Ying Liu, Luhua Lai
Journal: ChemMedChem (2016): 713--717
Cell polarity kinase MST4 cooperates with cAMP-dependent kinase to orchestrate histamine-stimulated acid secretion in gastric parietal cells
Authors: Hao Jiang, Wenwen Wang, Yin Zhang, William W Yao, Jiying Jiang, Bo Qin, Wendy Y Yao, Fusheng Liu, Huihui Wu, Tarsha L Ward
Journal: Journal of Biological Chemistry (2015): 28272--28285
Regulation of NDR1 activity by PLK1 ensures proper spindle orientation in mitosis
Authors: Maomao Yan, Lingluo Chu, Bo Qin, Zhikai Wang, Xing Liu, Changjiang Jin, Guanglan Zhang, Marta Gomez, Alexander Hergovich, Zhengjun Chen
Journal: Scientific reports (2015): 10449
Trypanosoma brucei vacuolar transporter chaperone 4 (TbVtc4) is an acidocalcisome polyphosphate kinase required for in vivo infection
Authors: Noelia Lander, Paul N Ulrich, Roberto Docampo
Journal: Journal of Biological Chemistry (2013): 34205--34216
