ATTO 488 NHS酯

染色样本分析

溶液配制

原液溶液配制：

1.蛋白质原液（溶液A）

将 100 µL 反应缓冲液（例如，pH ~9.0 的 1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白浓度 > 2 mg/mL（如果可能））混合，得到1 mL 蛋白质标记储备液。

注：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调节至 8.0-9.0 范围。

注意：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（pH 7.2-7.4）中。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须用 1X PBS（pH 7.2-7.4）进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和醋酸铵）。

注意：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得标记结果。

注意：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，结合效率会明显降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

2.ATTO 488 NHS酯原液（溶液 B）

将无水 DMSO 添加到 ATTO 488 NHS 酯小瓶中，制成 10 mM 原液。通过移液或涡旋充分混合。

注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。延长储存染料原液可能会降低染料活性。溶液 B 在避光、防潮的情况下可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

操作步骤

该标记方案是针对山羊抗小鼠 IgG 与 ATTO 488 NHS 酯的缀合物而开发的。实际情况您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

1.进行缀合反应：

1.1 使用摩尔比为 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到小瓶中有效摇动的蛋白质溶液（95 µL 溶液 A）。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质浓度为 ~0.05 mM，蛋白质分子量为 ~200KD。

注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）摩尔比为 10:1 的溶液。如果太少或太高，则分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

1.2 继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

2.纯化缀合物

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。

2.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。

2.2将反应混合物（来自“进行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

2.3当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

2.4向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质缀合物的级分。

注意：为了立即使用，染料-蛋白质缀合物必须用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注意：为了长期保存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

参考文献