别藻蓝蛋白APC

产品基本信息

分子量：~105,000

Ex(nm):651

Ex(nm):662

荧光量子产率（QY）：0.68

 

产品介绍

别藻蓝蛋白 APC是由藻胆蛋白提取出的一种荧光染料。藻胆蛋白由许多亚基组成，每个亚基具有蛋白质骨架，线性四吡咯发色团与其共价结合。藻红蛋白（红色）和藻蓝蛋白（蓝色）是两种主要的藻胆蛋白。藻红蛋白（PE）的吸收大值介于490和570nm之间，而藻蓝蛋白（PC）的吸收大值介于610和665nm之间。通常，当作为硫酸铵沉淀物冷藏储存时，藻胆蛋白具有良好的长期稳定性。纯化的胆脂蛋白可以在酸性或碱性条件下解离成亚基，但在室温下在中性pH下相对稳定，浓度大于0.1mg / mL。解离的亚基通常具有比天然色素更低的着色和荧光。建议将所有藻胆蛋白及其结合物（优选在中性缓冲溶液中）冷藏，从不冷冻。

 

藻胆蛋白[包括B-藻红蛋白（B-PE），R-藻红蛋白（R-PE）和别藻蓝蛋白（APC）]是用于生物学检测的超灵敏荧光染料。 它们比传统的有机荧光团灵敏度高100倍。 即使在诸如流式细胞术和免疫测定的实际应用中，藻胆蛋白缀合的抗体的灵敏度通常远大于相应的有机分子缀合物的灵敏度。 Phycobiliproteins是亮的荧光标签，具有多个位点，可与许多生物和合成材料形成稳定的结合。

 

• 藻红蛋白（B-PE）具有三个吸收带，在545nm处具有大吸收。 B-PE的亚基结构类似于R-PE，但亚基的发色团含量不同，导致吸收峰的相对强度不同：α和β亚基仅含有PEB，而γ亚基含有PEB和PUB。 B-PE存在于蓝细菌和红藻中。 B-PE的强烈粉红色和橙色荧光几乎与肉眼无法区分的R-PE。别藻蓝蛋白在主要的藻胆蛋白中是不稳定的，在低浓度下易于解离，包括进行某些测定的浓度。 出于这个原因，许多研究人员更喜欢使用在α和β亚基之间化学交联的CL-APC，并且比APC更稳定。

 

• 藻红蛋白（R-PE）从红藻中分离。其主要吸收峰位于565nm，第二峰位于496nm和545nm。 次生峰的相对突出性在来自不同物种的R-PE之间显着不同。R-PE具有三种类型的亚基：α（~20,000道尔顿），β（~20,000道尔顿）和γ（~30,000道尔顿）。已发现完整R-PE的分子量为约240,000道尔顿，并且已确定（αβ）6γ的亚基结构。R-PE的α亚基仅含有藻红蛋白（PEB）发色团，而β和γ亚基含有PEB和藻蓝蛋白（PUB）。来自不同物种的R-PE的吸收光谱的可变性反映了亚基的PEB / PUB比率的差异。R-PE和密切相关的B-PE是强荧光的藻胆蛋白，其量子效率可能超过90％，并且在任何中等浓度的溶液中，其橙色荧光很容易被肉眼看到。

 

C-藻蓝蛋白（C-PC）在许多蓝细菌中作为主要的藻胆蛋白发生，在一些红藻中作为次生的藻胆蛋白发生。该颜料在615和620nm之间具有单个可见吸收大值，在~650nm处具有大荧光发射。其分子量在70,000至110,000道尔顿之间。颜料由两个亚基α和β组成，它们以相同的数量出现，但构成分子的α和β对的确切数目可能因物种而异。α和β亚基都仅含有PCB发色团。 除了直接吸收光之外，这种强烈的蓝色颜料通过荧光能量转移接受来自藻红蛋白的量子，其中存在PE的生物体。C-PC的红色荧光转移到别藻蓝蛋白。AAT Bioquest研发的RPE、APC试剂及试剂盒被国内外科研人员灵活运用，达到不俗的科研成果。

APC偶联抗体的详细参考步骤：APC conjugation of antibodies (drmr.com)

 

图示

图1.藻蓝蛋白（APC）是一种与藻蓝蛋白，藻红蛋白和藻红蛋白同时存在的光采藻胆蛋白家族蛋白。 它是叶绿素的辅助色素。 所有藻胆蛋白都是水溶性的，因此不能像类胡萝卜素那样存在于膜内，而是聚集形成聚集在膜上的簇，称为藻胆体。 藻蓝蛋白吸收并发出红光，并且容易在蓝藻和红藻中发现。 藻胆素颜料具有出色的荧光特性，对于流式细胞仪的免疫测定非常有用。

 

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APC与抗体的缀合实验方案

注1：整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对APC的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml 的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2：SMCC-APC缀合物非常稳定（在“交换缓冲液”中，在 4C 下至少可以稳定几个月）。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 APC，并将其用于几次抗体实验（在几周内）。SMCC-APC 的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

 

一.APC的制备

1.将 APC 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10 mg/ml。注意：APC 在缀合前作为 SAS（硫酸铵钠）沉淀物最稳定。如果将 APC 以 SAS 沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升 1 升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升 1 升 APC 的 PBS 进行透析 2 次。

2.使用1.7毫克R-APC修饰每毫克IgG，包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。 

3.检查 APC 纯度，请测量 280、620 和 655 nm 处的吸光度。 （1 mg/ml 的 APC 在 655nm 处的 OD 为 5.9）。 655/620 比率 >1.4 表明污染藻蓝蛋白被充分去除； 655/280 比率 > 4 表明所有其他蛋白质均已充分去除。

 

二.APC的活化

1.使用前在无水 DMSO 中制备 10 mg/ml 的 SMCC 储备溶液。

2.每毫克 APC 加入 6 µl SMCC，并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转 60 分钟。

3.将纯化的 APC 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC 相对于 APC 的量，可能会有所好转。

 

三.IgG还原

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT (15.4 mg/100 µl) 的新鲜溶液。

2.IgG 溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和 TRIS 缓冲液（pH 范围为 6 至 8）已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml，则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加 10%。

3.用 DTT 配制 20 mM IgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20 µl DTT 原液并搅拌。室温下静置 30 分钟，无需额外搅拌（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

4.将还原的IgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分IgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。

 

四.进行缀合

1.每毫克 IgG 添加 1.5 毫克 SMCC-APC。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转 60 分钟。注意：这些摩尔比（每 IgG 约 2 个 APC）效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60 分钟后，必须去掉 IgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克 IgG 添加 34 µg (3.4 µl)。室温下包裹并旋转 20 分钟。

 

参考文献

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